химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

,45, при этом значительно увеличивается вязкость раствора. Появившийся осадок немедленно удаляют центрифугированием (5 мин, 2000 g), после чего доводят насыщение (NH4)2S04 до 0,48—0,50. Появляется опа-лесценция, которая постепенно увеличивается, выпадают шелковистые нити. В последующие дни насыщение постепенно увеличивают не более чем на 0,1—0,2 в день. После получения конечного насыщения (0,8) весь активный белок кристаллизуется в течение двух дней. Для перекристаллизации суспензию кристаллов центрифугируют 1 ч при 20 000g. Маточный раствор осторожно отсасывают, кристаллы растворяют в 0,1 М растворе фосфатного буфера, рН 7,0 (1/5—1/3 часть объема суспензии), постепенно добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до насыщения 0,8.

Метод II Реактивы:

1. Триэтаноламин — 50 мМ раствор, рН 8,2, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол (раствор для экстракции).

2. Имидазол — 10 мМ раствор, рН 6,6, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный меркаптоэтанол (буфер А).

3. Имидазол — 10 мМ раствор, рН 7,2, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол (буфер Б).

4. Имидазол — 10 мМ раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА; 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол и 7 мМ фруктозо-6-фосфат (или 3 мМ глюкозо-6-фосфат), рН 7,2.

5. Триэтаноламин — 25 мМ раствор, рН 8,2, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол.

6. (NH4)2S04 — насыщенный раствор, приготовленный на 25 мМ растворе триэтаноламина, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол, рН 8,2.

Растворы готовят на бидистиллированной воде. Работу проводят в холодной комнате.

Получение экстракта. Мышечную массу (с. 221) взвешивают и гомогенизируют 1 мин в двойном объеме раствора для экстракции. Доводят рН гомогената до 6,6 и продолжают экстракцию при перемешивании на механической мешалке еще 30 мин. Центрифугируют 15 мин при 20 000 g. Супернатант фильтруют через стекловату и диализуют в течение ночи против буфера А.

Хроматография на фосфоцеллюлозе. Подготовленную для работы фосфоцеллюлозу (циклизацию проводят, как указано на с. 109) уравновешивают буфером А и добавляют к раствору белка (примерно 20 г сухой фосфоцеллюлозы на раствор белка, полученный из 200 г мышц). Смесь перемешивают 20 мин, затем переносят на воронку Бухнера и фильтруют под небольшим давлением. Фосфоцеллюлозу отмывают от несвязавшегося белка буфером А (примерно 5 л) до тех пор, пока оптическая плотность элюата при 280 нм будет равна 0,01. После этого фосфоцеллюлозу суспендируют в 1 л буфера Б и рН осторожно доводят до 7,2 NaOH. Этим же буфером вновь отмывают фосфоцеллюлозу от несвязавшихся белков (примерно 7 л).

Элюция фермента. Фосфоцеллюлозу помещают в колонку диаметром 7,5 см, высота слоя ионообменника — 8 см. Для элюции использу

ют 350 мл 10 мМ имидазола, содержащего 0,1%-ный меркаптоэтанол и 3 мМ глюкозо-6-фосфат, рН 7,2. Глюкозофосфатизомераза элюиру-ется буфером (100—150 мл), содержащим субстрат.

Кристаллизация. После аффинной элюции можно провести кристаллизацию фермента. Элюат, содержащий глюкозофосфатизомеразу, диализуют в течение ночи против насыщенного сульфата аммония, приготовленного на 25 мМ триэтаноламине, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол, рН 8,2. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в том же буфере; разводят до концентрации белка 10 мг/мл. К раствору белка медленно на холоду добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 48%-ного насыщения. Выпавший при этом аморфный осадок удаляют. Раствор белка оставляют на ночь при комнатной температуре для кристаллизации.

Примечание. Так как препараты фосфоцеллюлозы отличаются между собой, целесообразно предварительно установить количество ионообменника, необходимое для связывания фермента. Берут (в расчете на сухой вес) 5 г фосфоцеллюлозы, уравновешенной буфером А, и добавляют определенную порцию раствора белка. В элюате определяют активность глюкозофосфатизомеразы. Последующие порции белка добавляют до полного насыщения ионообменника ферментом. На основе этих данных рассчитывают количество фосфоцеллюлозы, требующееся для связывания всего фермента. Суспензию перемешивают 30—40 мин, после чего в элюате определяют ферментативную активность, чтобы убедиться в полноте адсорбции фермента.

ЛИТЕРАТУРА

!. Gracy R. W. Glucosephosphate Isomerase from catfish muscle and liver and from mammalian tissues//Methods in Enzymology. 1982. Vol. 89. P. 550.

2. Phillips Т., Talent J., Gracy R. Isolation of rabbit muscle Glucosephosphate Isomerase by a single step substrate e!ution//Biochem. Biophys. Acta. 1976. Vol. 429, N 2 P. 624.

3. Simon L M, Kotorman M., Szajani B. et al. Preparation and characterization of immobilized glucosephosphate isomerase//Enzyme Microb. Technol. 1986. Vol. 8. N 4. P. 222.

4. N о 11 m a n n E. A. Phosphoglucose Isomerase rabbit muscle cristaIine//Methods in Enzymology. 1966. Vol. 9. P. 557.

5. D у s о n E., N о 11 m a n n E. A. The effect of pH and temperature on the kinetic parameters of phosphoglucose isomerase//J. Biol. Chem. 1968. Vol. 243, N 7. P. 1401.

7. ФОСФОФРУКТОКИНАЗА

страница 120
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
цветочная арка цена
маленькие комедии спектакль аронова
курсы 1с склад в митино
атерома стоимость удаления

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)