химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

620 нм (окраска стабильна при комнатной температуре в течение нескольких часов). Одновременно с исследуемыми растворами ставят контрольную пробу с дистиллированной водой и со стандартным раствором несколько проб (с различными количествами глюкозы) для построения калибровочного графика.

Определение гликогена. Исследуемую пробу предварительно обрабатывают щелочью для разрушения простых Сахаров. При высоком содержании гликогена в пробе определение проводят «прямым» методом, т. е. непосредственно из раствора. «Прямой» метод применяется при определении гликогена в ткани печени, в опытах с добавлением гликогена. Если содержание гликогена в пробе мало, то перед определением его осаждают спиртом — «непрямой» метод. Предварительное отделение гликогена в этом случае необходимо потому, что окраску с антроном дают также и продукты гидролиза белка, и при небольших количествах гликогена это не может не сказаться на результатах определения.

«Прямой» метод. В пробирки, содержащие 25—100 мг ткани, 1 мл гомогената или безбелкового раствора, добавляют по 3 мл 30%-ного раствора едкого калия. Пробы закрывают пробками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры, содержимое пробирок количественно переносят в мерные колбочки на 25—50 мл в зависимости от содержания гликогена в пробах (1 мл получаемого раствора должен содержать от 3 до 30 мкг гликогена) и объем доводят водой до метки. В широкие пробирки берут по 2,5 мл полученного раствора, ставят их в лед, добавляют при встряхивании 5 мл раствора антрона, тщательно перемешивают, погружают на 10 мин в водяную баню при 90° С, затем охлаждают и фотометрируют при 620 нм.

Параллельно с исследуемыми растворами ставят контрольную пробу с дистиллированной водой и пробы со стандартными растворами глюкозы.

Для расчета содержания гликогена найденное по калибровочному графику количество глюкозы (калибровочный график строится по глюкозе) умножают на коэффициент 0,9, так как молекулярный вес глю-козного остатка в гликогене равен 162, а молекулярный вес глюкозы — 180 (162: 180=0,9).

«Непрямой» метод. В центрифужную пробирку берут 25— 100 мг исследуемой ткани, 1 мл гомогената или безбелкового фильтрата, добавляют 3 мл 30%-ного раствора КОН и нагревают в кипящей водяной бане в течение 20 мин. Затем пробы охлаждают, добавляют равный объем (4 мл) спирта, хорошо перемешивают стеклянной палочкой и помещают в кипящую водяную баню. Когда спирт закипит, пробы охлаждают и осадок гликогена отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок гликогена растворяют в 1 мл дистиллированной воды

ш снова осаждают равным объемом спирта, нагревая пробу до кипения в кипящей водяной бане. Осадок гликогена отделяют центрифугированием, подсушивают на воздухе, растворяют в 2,5 мл дистиллированной (воды и проводят колориметрическое определение, как указано выше.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА ПОСЛЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ГЛЮКОАМИЛАЗОЙ ИЗ ASPERGILLUS NIGER

Гликоген отделяют от мешающих определению веществ (глюкозы, сахарозы, гексозофосфатов, глицерина) путем осаждения спиртом на фильтровальную бумагу, затем гидролизуют глюкоамилазой (КФ 3.2.1.3) и определяют энзиматическим методом с глюкозооксидазой.

Реактивы:

1. Этиловый спирт — 66%-ный раствор.

2. Трихлоруксусная кислота — 10%-ный раствор.

3. Ацетон.

4. Глюкоамилаза (10 мг фермента растворяют в 1,0 мл НгО, осадок удаляют центрифугированием).

5. Ацетатный буфер — 0,1 М раствор, рН 4,8.

6. Реактивы для определения глюкозы глюкозооксидазным методом (с. 19).

10—100 мкл исследуемого раствора, содержащего 10—50 мкг гликогена, наносят на квадратики фильтровальной бумаги размером 2X2 см. Их сразу же помещают в бюксы с 10 мл смеси 66%-ный этанол — 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, стоящие на льду (отдельно для каждого образца). Через 10 мин смесь заменяют тем же объемом 66%-ного этанола комнатной температуры и эту процедуру повторяют 3 раза в течение часа. Затем каждый квадратик бумаги помещают на 5 мин в ацетон, сушат чад лампой в течение 10 мин, измельчают ножницами и помещают в пробирку, в которую приливают 0,9 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,8) и 0,1 мл раствора глюкоами-лазы. Пробы перемешивают и инкубируют в течение 3 ч при 30° С. В качестве контроля используют пробу, содержащую измельченный квадратик чистой фильтровальной бумаги такого же размера. По окончании инкубации к каждой пробе приливают по 3 мл рабочего реактива для определения образовавшейся глюкозы глюкозооксидазным методом. Определение проводят, как указано на с. 20. Количество гликогена рассчитывают по калибровочному графику, построенно--му по глюкозе, учитывая коэффициент пересчета, равный 0,9 (с. 24).

5. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Выделение гликогена из печени кролика или крысы состоит в экстракции ткани 3%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и последующего осаждения этиловым спиртом.

Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота — 3%-

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
пазогребневые блоки в москве
HP Q7551X
http://taxiru.ru/shashechki-30-sm/
купить билеты в театр маяковского

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.08.2017)