химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

осфатизомеразы из скелетных мышц кролика

Метод I

Реактивы:

1. КС1 — 0,01 М раствор, приготовленный на 1,5 мМ растворе ЭДТА, рН 7,0 (раствор для экстракции).

2. Zn(CH3COO)2 — 1 М раствор.

3. NaOH — 1 н. раствор.

4. Цитрат аммония — 0,25 М раствор, рН 8,5.

5. (NH4)2S04 — сухой, перекристаллизованный из 5 мМ раствора ЭДТА при рН 8,2.

6. Mg(CH3COO)2*4H20 — 0,1 М раствор.

7. NH4OH — 0,5 н. раствор.

8. ЭДТА — 0,025 М раствор, рН 8,0.

9. Этиловый спирт.

10. Ацетон.

11. СНзСООН — 0,2 н. раствор.

12. Бентонит.

13. Трис-HCl — 0,2 М раствор, рН 8,0.

14. NaHP04 — 0,1 М раствор.

15. (NH4)2S04 — насыщенный раствор.

Растворы готовят на бидистиллированной воде Работу при выделении фермента проводят в холодной комнате.

Получение экстракта. Измельченную мышечную массу (с. 221) взвешивают и гомогенизируют 1 мин в двойном объеме раствора для экстракции. Второй раз гомогенизируют в равном по весу объеме того же раствора. Перемешивают гомогенат еще 15 мин на механической мешалке, после чего центрифугируют 15 мин при 15 000 g". Объем этой фракции считают равным объему добавленного КС1 (фракция 1).

Фракционирование ацетатом цинка. Добавляют 1,0 М ацетат цинка до конечной концентрации 0,03 М и доводят рН до 8,5, добавляя 1 н. раствор NaOH, предварительно охлажденный до 0°С. Через 1—2 ч плотную белую суспензию центрифугируют (15 мин, 15 000 g). Осадок суспендируют в 0,25 М цитрате аммония, рН 8,5 (добавляют 1/5 часть объема от фракции 1) и оставляют на ночь. На следующий день осадок удаляют центрифугированием (30 мин, 15 ООО g). Промывают осадок 0,25 М цитратом аммония, рН 8,5 (используют 1/15 часть объема фракции 1). Оба раствора соединяют. Получают слегка мутный красный раствор (фракция 2).

Фракционирование сульфатом аммония. Фракцию 2 доводят сухим сульфатом аммония до насыщения 0,33. Осадок удаляют центрифугированием (20 мин, 15 ОООg"). Насыщение сульфата аммония в суперна-танте увеличивают до 0,63; затем центрифугируют (30 мин, 15000g) и осадок растворяют в 0,025 М ЭДТА рН 8,0 (в 1/8 части объема фракции 2), раствор диализуют против 0,005 М ацетата магния в течение ночи. Нерастворившийся осадок удаляют. Получают прозрачный раствор (фракция 3).

Фракционирование спиртом. Определяют содержание белка во фракции 3 и разводят ее 0,005 М раствором ацетата магния так, чтобы концентрация белка была равна 15 мг/мл. Доводят рН раствора до 8,6 охлажденным 0,5 н. раствором аммиака После этого раствор белка помещают в баню при —10° С и добавляют небольшими порциями хорошо охлажденный 96%-ный этанол в таком количестве, чтобы конечная концентрация его была равна 34%. Температура раствора белка не должна превышать 0°С. Через 20 мин после добавления последней порции спирта раствор центрифугируют при —15° С 15 мин (15 000 g"). Осадок отбрасывают, а в супернатанте увеличивают концентрацию спирта до 64% Снова центрифугируют в тех же условиях, полученный осадок суспендируют в 0,1 М растворе ацетата магния в объеме, равном 1/4 части объема фракции 3, имеющей концентрацию белка около 15 мг/мл. Суспензию центрифугируют 20 мин при 15 000 ^ и получают прозрачный темно-желтый раствор (фракция 4)

Фракционирование ацетоном. Фракцию 4 обрабатывают ацетоном, добавляя такое его количество, чтобы конечная концентрация была равна 40%- Ацетон предварительно охлаждают до —10° С и вносят медленно, поддерживая температуру смеси около 0°С. Затем центрифугируют при —5° С 15 мин (15 000g). Осадок отбрасывают, а в супернатанте увеличивают концентрацию ацетона до 50%. Через 10 мин снова центрифугируют в тех же условиях и полученный осадок растворяют в 0,05 М растворе ацетата магния, используя его в объеме, примерно равном 1/2 от объема фракции 4. Получают опалесцирующий светло-желтый раствор белка (фракция 5).

Фракционирование бентонитом. Определяют содержание белка во фракции 5 и затем разводят ее так, чтобы концентрация белка была равна 7 мг/мл. Для этого используют 0,05 М раствор ацетата магния, рН доводят до 7,4, добавляя охлажденный 0,2 н. раствор уксусной кислоты. Тщательно перемешивая раствор белка, вносят в него бентонит (4 г на 1 г белка). Перемешивание продолжается 10 мин, после чего адсорбент немедленно удаляют центрифугированием при lSOOOg" в течение 30 мин. Получают светлый супернатант (фракция 6).

Концентрирование раствора белка ацетоном. После обработки бентонитом концентрируют раствор белка, медленно добавляя равный объем ацетона, охлажденного до —10° С (не допускают повышения температуры выше 0°С). Через 10 мин после добавления последней порции ацетона молочно-белый раствор центрифугируют (15 мин при 15 000 g). Небольшой осадок растворяют (в 1/200—1/100 части от объема фракции 6) в 0,2 М раствора триса (рН 8,0) и подвергают диализу в течение ночи против 1000-кратного объема 0,01 М раствора фосфата натрия, рН 7,0 (фракция 7).

ivpметаллизация. j\ раствору оелка, имеющему концентрацию 30 мг/мл (более низкая концентрация нежелательна), добавляют нейтрализованный насыщенный раствор (NH4)2S04 до насыщения 0

страница 119
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы эксель в переделкино
Рекомендуем компанию Ренесанс - лестницы для дома фото - оперативно, надежно и доступно!
ножи кониг
киркоров концерт апрель

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)