химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

Ray W. J., Peck Е. J. Phosphoglucomutase//The Enzymes/Ed. P. Boyer. N. Y., 1972 Vol. 6. P. 407.

2. Ray W. J., Hermodson M., Puvathingel J., Mohoney W. The complete amino acid sequence of rabbit muscle Phosphoglucomutase//J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258, N 15. P. 9166.

3. J о s h i J. G., Lane R. Rabbit muscle phosphoglucomutase is a monomer//Biochem. Biophys. Res. Com. 1978. Vol. 85, N 2. P. 729.

4. Jos hi J. G. Phosphoglucomutase from yeast//Methods in Enzymology. N. Y., 1982. Vol. 89. P. 599.

5. Possonneau J., Lowry O., Schulz D., Brown J. Glucose 1,6-diphosphate formation by phosphoglucomutase in mammalian tissues//1. Biol. Chem. 1969. Vol. 244, N 4. P. 902.

6. ГЛЮКОЗОФОСФАТИЗОМЕРАЗА

(D-глюкозо-б-фосфат-кетол-изомераза, КФ 5.3.1.9)

Глюкозофосфатизомераза катализирует обратимую реакцию изомеризации, в которой глюкозо-6-фосфат (альдоза) превращается во фруктозо-6-фосфат (кетозу). Реакция легко протекает в обоих направлениях, так как изменение свободной стандартной энергии невелико

(AG0 = +0,4 ккал/моль).

Глюкозофосфатизомераза является димером с молекулярной массой 132 000 Да; состоит из двух идентичных субъединиц. После обработки 6 М гуанидин-HCl молекула диссоциирует на субъединицы с молекулярной массой 62 000 Да. Фермент обладает высокой специфичностью по отношению к D-глюкозо-б-фосфату (Кт=0,12 мМ) и D-фрук-тозо-6-фосфату (Кт=0,07 мМ при 30° С, рН 8,2), не катализирует изомеризацию других фосфосахаров.

В тканях млекопитающих глюкозофосфатизомераза существует в виде одного изозима. Множество обладающих активностью полос, наблюдаемых при электрофорезе, является следствием его нестабильности. При хранении в растворе, содержащем ЭДТА и 2-меркаптоэтанол (или дитиотреитол), структура фермента стабилизируется. Для проявления ферментативной активности фосфоглюкозоизомераза не требует каких/"> i"l /"Ч

либо активаторов или кофакторов. рН-Оптимум активности ее наблюдается в области рН 8,0—8,5. Фермент конкурентно ингибируется 6-фосфоглюконатом {/G=0,06 мМ), эритрозо-4-фосфатом, рибозо-5-фос-фатом и в меньшей степени другими фосфосахарами.

Определение активности глюкозофосфатизомеразы

Активность глюкозофосфатизомеразы может быть определена двумя методами: химическим — по измерению образующегося в прямой реакции фруктозо-6-фосфата (количество фруктозо-6-фосфата определяют по фруктозе) и энзиматическим — по измерению образующегося глюкозо-6-фосфата в обратной реакции (количество глюкозо-6-фосфата определяют в сопряженной системе с помощью дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата). Скорость ферментативной реакции регистрируют спектро-фотометрически по нарастанию НАДФН (см. с. 7).

Химический метод

Реактивы:

1. Трис-HCl — 0,5 М раствор, рН 8,3.

2. Глюкозо-6-фосфат — ]Ма2-соль, 0,1 М раствор.

3. НС1 — 8 н. раствор.

4. NaOH — 0,1 н. раствор.

5. Фосфоглюкозоизомераза.

6. Реактивы для определения фруктозы (с. 41).

Раствор субстрата (глюкозо-6-фосфата) предварительно разводят до концентрации 20 мМ (к 2 мл глюкозо-6-фосфата добавляют 1 мл 0,5 М раствора триса, объем доводят до 10 мл водой, рН 8,3). Реакционная смесь в 1 мл содержит: 50 мМ трис, рН 8,3, 4 мМ глюкозо-6-фосфат. Пробы инкубируют 1—2 мин при 37° С, после чего реакцию начинают добавлением глюкозофосфатизомеразы (в объеме 25— 50 мкл). Останавливают реакцию добавлением 8 н. НС1. Контрольную пробу инкубируют без фермента. Ферментативную реакцию измеряют в различные промежутки времени с интервалом 30 с.

Энзиматичес кий метод

ФруКТОЗО-6-фОСфаТ ™юкозофосфатизомераза_^ ГЛЮКОЗо-6-фосфаТ

дегидрогеназа глгоко-зо-6-фосфата-! НАДФ"Ь

6-фосфоглюконо-б-лактон -f НАДФН + Н+

Реактивы:

1. Триэтаноламин — 55 мМ раствор, рН 8,3.

2. ЭДТА — 3 мМ раствор, рН 8,3.

3. Фруктозо-6-фосфат — 1^а2-соль 0,12 М раствор, рН 8,3.

4. НАДФ — 15 мМ раствор, рН 6,5.

5. Дегидрогеназа глюкозо-6-фосфата.

6. Глюкозофосфатизомераза.

В спектрофотометрическую кювету вносят следующие компоненты реакции (указаны^ конечные концентрации): 50 мМ триэтаноламин, рН 8,3, 1 мМ ЭД'1 А, 4 мМ фруктозо-б-фосфат, 0,Ь мм НАДФ, 1 ед/мл дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата. Преинкубируют 5 мин. Во время преинкубации присутствующий в препарате фруктозо-6-фосфата в качестве примеси глюкозо-6-фосфат окисляется. Только после этого начинают реакцию добавлением глюкозофосфатизомеры (в объеме 25— 30 мкл), разведенной 10 мМ триэтаноламином, содержащим 1 мМ ЭДТА, рН 8,3.

Определение белка. Для определения белка используют микро-биуретовый метод (см. с. 81). В случае спектрофотометрического определения концентрацию белка рассчитывают с учетом коэффициента поглощения Л1%1см=13,2 при 280 нм.

Примечание. Если в препарате дегидрогеназы глюкозо-б-фосфата имеется примесь дегидрогеназы-6-фосфоглюконата, при энзимати-ческом методе определения активности фосфоглюкозоизомеразы образуется 6-фосфоглюконат — конкурентный ингибитор фермента. Учитывая количество образовавшегося 6-фосфоглюконата, вносят поправку при расчете активности фосфоглюкозоизомеразы.

Выделение и очистка глюкозоф

страница 118
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Sinix 5090
купить качели для взрослых
Столы ЛДСП
Ручная мельница 2 в 1 для соли и перца Acacia MP90 21 см

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.01.2017)