химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ЭДТА.

6. Na2HP04 — 1 мМ раствор, рН 7,8, содержащий 0,1 мМ ЭДТА.

7. Na2HP04 — 1 мМ раствор, рН 7,8, содержащий 0,1 мМ ЭДТА

и 0,2 М NaCl.

8. ДЭАЭ-целлюлоза.

9. Na2HP04—НС1 - 0,1 М раствор, рН 7,0 (разводят ОД мМ раствором ЭДТА, рН 7,0).

10. КМ-сефадекс. 11. Na2HP04 — 50 мМ раствор, рН 7,0, содержащий ОД мМ ЭДТА и 1 мМ Mg2+. Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Работу проводят при 0—4° С.

Получение экстракта. Измельченную мышечную массу (с. 221) взвешивают и заливают двойным объемом раствора для экстракции. Гомогенизируют 30 с, отжимают через ткань. Мышечную массу повторно гомогенизируют в одном объеме раствора. Экстракты объединяют и центрифугируют 20 мин при lOOOOg.

рН-Осаждение. Супернатант доводят 0,5 н. СНзСООН до рН 5,5. Выпавший осадок отделяют центрифугированием (10 мин, 20 000 g).

Тепловая обработка. В водяную баню, нагретую до 90° С, помещают раствор белка и при постоянном перемешивании доводят температуру раствора до 63° С, после этого сразу же помещают раствор белка в охлаждающую смесь (лед с солью), доводят его температуру до 4—6°, перемешивают. Осадок удаляют центрифугированием (10 мин, 20 000 g).

Фракционирование сульфатом аммония. Супернатант доводят аммиаком до рН 7,0 и медленно добавляют сухой сульфат аммония до 45%-ного насыщения. Перемешивают еще 30 мин и центрифугируют 20 мин при 20 000 g. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 75%-ного насыщения при постоянном перемешивании. Осадок, содержащий фосфоглюкомутазу, собирают центрифугированием и растворяют в 1 мМ растворе Na2HP04, рН 6,8, содержащем ОД мМ ЭДТА. Раствор днализуют в течение ночи против того же буфера. После диализа центрифугируют и супернатант разводят до концентрации белка 5—8 мг/мл; доводят рН раствором аммиака до 7,8.

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Прозрачный раствор белка

наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (5x70 см). Колонку предварительно уравновешивают 1 мМ раствором Na2HP04, рН 7,8; содержащим 0,1 мМ ЭДТА и после нанесения белка промывают 1 л того же буфера. Для элюции используют градиент концентрации 0—0,2 М NaCl (2 л буфера без NaCl и 2 л буфера, содержащего 0,2 М NaCl). Фракции с одинаковой активностью объединяют и добавляют сульфат аммония до 75%-ного насыщения. Суспензию центрифугируют. Супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в воде и диализуют в течение суток против 1 мМ Na2HP04, 0,Т мМ ЭДТА, рН 7,0. После диализа центрифугируют.

Хроматография на КМ-сефадексе. Супернатант разводят до концентрации белка 5 мг/мл и наносят на колонку с КМ-сефадексом (2,5x50 см). Колонку предварительно уравновешивают буфером (1 мМ Na2HP04, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,0). После нанесения белка колонку промывают 500 мл того же буфера и элюируют в градиенте концентраций фосфатных буферных растворов (1 мМ и 33 мМ), содержащих 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,0. В элюате определяют концентрацию белка и ферментативную активность. Фракции, содержащие фосфоглюкому-тазу, объединяют и белок концентрируют добавлением сульфата аммония до 75% насыщения. Суспензию центрифугируют. Осадок растворяют в 50 мМ растворе Na2HP04, рН 7,0, содержащем 0,1 мМ ЭДТА и 1 мМ Mg2+.

Гель-хроматография. Полученный раствор наносят на колонку с сефадексом G = 100 (2,5x100 см). Уравновешивание колонки и элюцию осуществляют тем же буфером. Фракцию фермента разливают на порции и хранят при —70° С.

Синтез глюкозо-1,6-дифосфата

Глюкозо-1,6-дифосфат может быть ферментативно синтезирован с помощью фосфоглюкомутазы в присутствии фруктозо-1,6-дифосфата. Фосфоглюкомутаза катализирует реакцию:

фруктозо-1,6-дифосфат + глюкозо-6-фосфат - фосфоглюкомутаза--^

~> фруктозо-6-фосфат -j- глюкозо-1,6-дифосфат.

Концентрацию глюкозо-1,6-дифосфата определяют по количеству глюкозо-6-фосфата, измеряемому с помощью глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы или после щелочного гидролиза (15-минутное нагревание при 100° С в 0,2 н. растворе NaOH — см. с. 40).

Реактивы:

1. Трис-HCl - 50 мМ раствор, рН 7,6.

2. НАДФ — 6 мМ раствор, рН 6,5.

3. Mg(CH3COO)2-4H20 — 0,3 М раствор.

4. Фруктозо-1,6-дифосфат — 15 мМ раствор, рН 7,6.

5. Глюкозо-1-фосфат — 60 мМ раствор, рН 7,6.

6. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

7. Фосфоглюкомутаза.

8. NaOH — 2 н. раствор.

9. Реактивы для определения неорганического фосфата (с. 33).

Составляют следующую реакционную смесь (указаны конечные концентрации): 40 мМ трис-HCl, рН 7,6; 0,2 мМ НАДФ; 10 мМ

Mg(CH3COO)2; 0,5 мМ фруктозо-1,6-дифосфат; 10 ед/мл фосфоглюкомутазы. Реакцию начинают добавлением 2 мМ глюкозо-1-фосфата. Инкубируют при 38° С в течение 10—15 мин. Останавливают реакцию нагреванием в течение 15 мин при 100° С. Белок удаляют центрифугированием. В супернатанте определяют количество образовавшегося глюкозо-1,6-дифосфата. Для этого глюкозо- 1,6-дифосфат превращают в глюкозо-6-фосфат 10-минутным гидролизом в 0,1 н. растворе НС1 при 100° С. Раствор нейтрализуют и определяют в нем глюкозо-6-фос-фат с помощью дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата или после щелочного гидролиза.

ЛИТЕРАТУРА

Е

страница 117
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ноутбук напрокат в москве
Рекомендуем компанию Ренесанс - лестница на чердак- быстро, качественно, недорого!
стул zeta цена
склад хранения вещей свао

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)