химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

фосфат, 0,2 мМ НАДФ, 10 мМ MgCl2, 0,5 ед/мл дегидрогеназы глюко-зо-6-фосфата (в объеме 50 мкл) и 0,02 ед/мл (в объеме 50 мкл) фосфоглюкомутазы. Реакцию начинают добавлением фосфоглюкомутазы. Смесь перемешивают и регистрируют нарастание оптической плотности при 340 нм.

Определение белка. Для определения концентрации фосфоглюкомутазы используют метод Лоури (см. с. 81). При спектрофотометриче-ском измерении регистрируют оптическую плотность при 278 нм, учитывая, что Л1°''0]СМ=7,0.

Выделение и очистка фосфоглюкомутазы из скелетных мышц кролика

Метод I

Реактивы:

1. СНзСООН - 1 н. раствор.

2. (NH4)2S04 — сухой, перекристаллизованный из раствора ЭДТА (1,5 г на 1 л).

3. Ацетатный буфер — 0,15 М, рН 5,0.

4. (NH4)2S04, насыщение 0,32.

5. (NH4)2S04, насыщение 0,65, раствор приготовлен на 0,05 М ацетатном буфере, рН 5,0.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

Получение экстракта. К 200—300 г измельченной мышечной массе (приготовление см. на с. 221) добавляют равный объем охлажденной бидистиллированной воды, экстрагируют 2 мин на холоде и перемешивают. Фильтруют через ткань (или несколько слоев марли), после чего экстракцию повторяют равным объемом воды. Экстракты соединяют и доводят 1 н. СНзСООН до рН 5,0.

Тепловая обработка. Мутный раствор подогревают на водяной бане (85—90° С) до тех пор, пока его температура достигнет 65° С, при этом раствор тщательно перемешивают. Затем нагревание прекращают, раствор помещают в сосуд с тающим льдом и охлаждают его до 40° С. Во время охлаждения раствор также перемешивают.

Фракционирование сульфатом аммония. К раствору, в котором на предыдущей стадии образуется осадок денатурированных белков, добавляют сухой мелко измельченный сульфат аммония до насыщения 0,2. После этого центрифугируют и осадок отбрасывают. В суперна-танте добавлением сухой соли (маленькими порциями при осторожном перемешивании) увеличивают насыщение сульфата аммония до 0,65. Через 15—20 мин после насыщения раствор центрифугируют (30 мин, 15000g). Осадок осторожно, но тщательно суспензируют в 0,15 М растворе ацетатного буфера, рН 5,0 (добавляют объем буфера, приблизительно равный объему осадка).

Повторная тепловая обработка. Мутный раствор с насыщением сульфата аммония, равным 0,32, помещают в водяную баню, нагретую до 65° С. Раствор перемешивают, доводят его температуру до 63° С и продолжают нагревание при 63° С в течение 3 мин. Раствор охлаждают до 4° С; выпавший обильный осадок удаляют центрифугированием (15 мин, 10 000 g). В супернатанте определяют концентрацию белка и разводят его раствором сульфата аммония с насыщением 0,32 так, чтобы концентрация белка стала равной 3—5 мг/мл. Затем увеличивают насыщение до 0,5 медленным (по каплям) добавлением насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают. Оставляют в сосуде с тающим льдом на 30 мин, центрифугируют и осадок отбрасывают. Прозрачный супернатант снова помещают в термостатированную баню при 30°С на 30 мин. Осадок, выпавший при нагревании, также отбрасывают, центрифугируя со скоростью 10 000g при комнатной температуре в течение 10 мин.

Кристаллизация. Супернатант помещают в лед, охлаждают до 1—3°С и очень медленно (в течение 2—2,5 ч) доводят насыщение до 0,55 насыщенным раствором сульфата аммония, осторожно перемешивая. Раствор сначала мутнеет, а через полчаса появляется характерная шелковистость Для кристаллизации его оставляют на ночь. На следующий день с теми же предосторожностями увеличивают насыщение до 0,6 и опять оставляют на сутки для более полной кристаллизации.

Перекристаллизация. Суспензию центрифугируют (30 мин, 15 000^, 4°С), кристаллический осадок растворяют в 0,15 М ацетатном буфере (рН 5,0) так, чтобы концентрация белка была равна 2—3 мг/мл. Раствор доводят до 0,5 насыщения, добавляя насыщенный раствор сульфата аммония, и нагревают 30 мин при 30° С. Осадок удаляют центрифугированием при комнатной температуре (20 мин, 10 000 g). Центрифугат охлаждают до 4° С и со всеми предосторожностями насыщение увеличивают л,о 0,6, добавляя насыщенный раствор сульфата аммония. Кристаллизация происходит в течение ночи при 4° С. Концентрацию сульфата аммония на следующий день увеличивают до 0,65. Перекристаллизацию повторяют 2—3 раза. По окончании этой процедуры кристаллы собирают центрифугированием (30 мин, 15 ООО g) и суспендируют в растворе сульфата аммония 0,65 насыщения, приготовленном на 0,15 М ацетатном буфере (рН 5,0). В этих условиях фермент стабилен и сохраняется при 4° С без потери активности в течение нескольких месяцев.

В качестве примеси в препарате фермента может быть альбумин крови. В случае загрязнения мышечной ткани кровью перед началом выделения можно промыть ткань физиологическим раствором.

Метод II

Реактивы:

1. К-фосфатный буфер — 30 мМ, рН 7,0, содержащий 1 мМ ЭДТА (раствор для экстракции).

2. СНзСООН — 0,5 н. раствор.

3. NH4OH — 1 н. раствор.

4. (NH4)2S04 — (сухой, перекристаллизованный из 5 мМ ЭДТА; рН 8,2; мелко измельченный).

5. Na2HP04 — 1 мМ раствор, рН 6,8, содержащий ОД мМ

страница 116
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ранункулюс лютик купить в москве
Фирма Ренессанс: лестница модульная купить - надежно и доступно!
кресло метро купить
Предложение от KNSneva.ru 10G9S00900 - кредит онлайн не выходя из дома в Санкт-Петербурге!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)