химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

-D-глюкозо-1-фосфат-фосфотрансфераза, КФ 2.7.5J)

Фосфоглюкомутаза катализирует внутримолекулярный перенос фосфата между Ci и С6 в глюкозе. Равновесная смесь содержит 95% глюкозо-6-фосфата. Реакция осуществляется в присутствии иона Mg2+~ и кофермента — глюкозо-1,6-дифосфата. Молекула фосфоглюкомутазы

из скелетных мышц кролика содержит одну полипептидную цепь с молекулярной массой 61 600 Да. Установлена полная последовательность всех 561 аминокислот, входящих в фермент. Фермент существует в двух формах: фосфорилированной и нефосфорилированной. Активной формой является фосфорилированная, образующаяся в качестве промежуточного продукта ферментативной реакции. Фосфорильная группа переносится от глюкозо-1,6-дифосфата на остаток серина-116, расположенный в активном центре фермента. В процессе катализа фермент выполняет роль донора и акцептора фосфата. Реакция, катализируемая фосфоглюкомутазой, протекает по следующей схеме:

Е—Р 4- глюкозо-1 -фосфат

Е—Р • глюкозо-6-фосфат

Н

Е—Р - глюкозо-1 -фосфат

U !

j Е ? глюкозо-1,6-дифосфат

н

^ Е + глюкозо-1,6-дифосфа^

Е— Р + глюкозо-6-фосфат

Субстрат и продукт реакции образуют комплексы с фосфорилиро-©анной формой фермента (Е—Р), а кофермент — с нефоефорилиро-ванной (Е). При недостатке глюкозо-1,6-дифосфата происходит диссоциация комплекса с образованием неактивного фермента. Для осуществления каталитического цикла необходимо присутствие некоторого избытка глюкозо-1,6-дифосфата. Изолированный из мышц кролика фермент обычно является фосфорилированным, поэтому может катализировать реакцию и без добавления кофермента. Важную роль в каталитической реакции играют ионы Mg2+, в отсутствие которых фермент вообще неактивен. Непосредственно в каталитическом акте Mg2+ не участвует, но, будучи связанным с фосфорильной группой фермента, оказывает влияние на равновесие реакции.

Кинетические параметры (измеренные по ферментативной активности) при варьировании концентрации глюкозо-1,6-дифосфата и глю-козо-1-фосфата зависят от соотношения концентраций этих компонентов. Величина Кт Для глюкозо-1-фосфата изменяется от 2,4-Ю-5 М до 4,8-10~4 М; для глюкозо-1,6-дифосфата — от 8,3-10~9 М до 7,6-10~8М. Кинетические параметры зависят также от того, находится ли фермент в активированном или неактивированном состоянии. Активацию фос-фоглюкомутазы проводят путем предварительной инкубации в среде, содержащей ионы Mg2+ и имидазол (или гистидин).

Фосфоглюкомутаза обладает широкой субстратной специфичностью, но превращение изомерных форм сс-/>глюкозы катализирует •со значительно меньшей скоростью. В присутствии глюкозо-1,6-дифос-4>ата фермент ингибируется фруктозо-1,6-дифосфатом и 2,3-дифосфо-глицератом.

Определение активности фосфоглюкомутазы

Активность фосфоглюкомутазы может быть определена двумя методами: химическим, основанным на определении убыли субстрата реакции, и энзиматическим — в сопряженной системе, содержащей помимо фосфоглюкомутазы и глюкозо-1-фосфата также НАДФ и дегидро-геназу глюкозо-6-фосфата. Последний фермент используется в избытке, и скорость реакции, катализируемой фосфоглюкомутазой, определяют по нарастанию НАДФН.

Для определения активности (при любом методе) препарат фермента подготавливают для работы, активируя его в среде, содержащей 1 мМ MgCb и 30 мМ гистидин (или имидазол). Смесь инкубируют 10—20 мин при 0° С. Предварительно растворы фосфоглюкомутазы и сопрягающего фермента (дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата) обессоливают на колонке с сефадексом G-25 (тонкий).

Химический метод Реактивы:

1. Трис-HCl — 80 мМ раствор, рН 7,6.

2. Глюкозо-1 фосфат — 20 мМ раствор, рН 7,5.

3. Глюкозо-1,6-фосфат — 10 мкМ раствор.

4. MgCl2 — 50 мМ раствор.

5. Фосфоглюкомутаза, активированная в присутствии 1 мМ Mg2f и 30 мМ гистидина (или имидазола).

6. Реактивы для определения неорганического фосфата (с. 33).

S*

997

В пробирки помещают реакционною смесь (объем 1 мл), состоящую из следующих компонентов (указаны конечные концентрации): 40 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, 2 мМ глюкозо-1-фосфат, 1 мкМ глюкозо-1,6-дифосфат, 10 мМ MgCl2 и 0,02 ед/мл фосфоглюкомутазы. Реакцию начинают добавлением фермента. Пробы инкубируют при 30° С, Активность определяют через каждые 30 с. Реакцию останавливают 1 н. H2SO4. Кислотный гидролиз глюкозо-1-фосфата проводят, как указано на с. 39.

Энзиматический метод

Глюкозо-1-фосфат Ф°сФ°""°«™Ут*" ^ глюкозо-6-фосфат

дегидрогеназа глюко зо-б-фосфата-f НАДФ+

г люконо-б-лактон-6-фосфат + НАДФН + Н+.

Реактивы:

1. Трис-HCl — 48 мМ раствор, рН 7,5.

2. Глюкозо-1-фосфат — 60 мМ раствор, рН 7,5.

3. Глюкозо-1,6-дифосфат — 30 мкМ раствор.

4. MgCl2 — 0,3 М раствор.

5. НАДО — 6 мМ раствор, рН 6,5.

6. Фосфоглюкомутаза, активированная в присутствии 1 мМ Mg2+r 30 мМ гистидина (или имидазола), рН 7,5.

7. Дегидрогеназа глюкозо-6-фосфата.

В спектрофотометрическую кювету объемом 3 мл помещают следующие компоненты (указаны конечные концентрации): 40 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5), 2 мМ глюкозо-1-фосфат, 1 мкМ глюкозо-1,6-ди

страница 115
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
https://wizardfrost.ru/remont_model_3.html
урна парковая уч-2
сдать анализы на прогестерон цена
прокат микроавтобусов в москве недорого на свадьбу

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.08.2017)