химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

алибровочному графику.

Концентрацию киназы фосфорилазы следует подобрать так, чтобы не более 20% добавленной фосфорилазы Ь превращалось в фосфори-лазу а за 5 мин. Одна единица активности — это количество фермента, катализирующего превращение 1 мкмоль фосфорилазы Ь в фосфо-рилазу а в 1 мин при 30° С, рН 8,2. Для расчета учитывают молекулярную массу субъединицы фосфорилазы, равную 97 400 Да; удельную активность фосфорилазы а в отсутствие АМФ принимают за 70% от активности фосфорилазы Ь, измеренной в присутствии АМФ.

Второй вариант

Киназная реакция. Реакционная смесь состоит из тех же компонентов, как в случае первого варианта, но вместо АТФ добавляют [у-32Р] АТФ.

Определение количества фосфорилазы а. Из реакционной смеси отбирают аликвоты и помещают их на диски фильтровальной бумаги (ватман 3 ММ). Белок, нанесенный на фильтры, фиксируют 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, после чего фильтры тщательно отмывают от не связанной с белком радиоактивной метки несколько раз сменяемым раствором 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Затем фильтры обрабатывают смесью абсолютного спирта и ацетона (1:1) и подсушивают в термостате при 70—80° С (или на воздухе). Сухие фильтры помещают во флаконы со сцинцилляционной жидкостью. Определение радиоактивности проводится методом жидкостной сцинцилляционной спектрометрии.

Получение частично очищенного препарата киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика

Реактивы:

1. ЭДТА — 4 мМ раствор — 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол (готовят перед употреблением), рН 7,0.

2. СНзСООН — 1 н. раствор.

3. Na-p-глицерофосфат 100 мМ — 4 мМ ЭДТА — 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол (последний добавляют перед использованием), рН 8,2 (буфер А).

4. Na-p-глицерофосфат 50 мМ — 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол (добавляют перед использованием), рН 7,0 (буфер Б). Растворы готовят на бидистиллированной воде. Работу проводят при 0—5° С.

Получение экстракта. Измельченную мышечную ткань (получение см. на с. 221) взвешивают, заливают 2,5-кратным объемом 4 мМ ЭДТА — 0,1%-ным 2-меркаптоэтанолом, рН 7, и гомогенизируют 30 с при небольшой скорости. Гомогенат центрифугируют при 6000 g 45 мин; супернатант фильтруют через стекловату.

рН-Осаждение. Измеряют рН полученного супернатанта; рН должен быть не менее 6,7—6,8. К раствору добавляют 1 н. СН3СООН (охлажденную) и доводят рН до 6,1—6,2. Через 15 мин помутневший раствор центрифугируют при 6000 g 45 мин. Супернатант отбрасывают; осадок суспендируют в буфере А (25 мл на 500 г мышц). Осадок диспергируют с помощью ручного гомогенизатора и затем разводят буфером Б до 70 мл.

Ультрацентрифугирование суспензии проводят при 78 000 g в течение 100 мин. Супернатант, содержащий киназу фосфорилазы, осторожно декантируют и фильтруют через стекловату.

4. ПОЛУЧЕНИЕ ФОСФОРИЛАЗЫ А

Фосфорилазу а получают из фосфорилазы 6, освобожденной от АМФ (с. 223). Реакцию катализирует киназа фосфорилазы в присутствии Mg—АТФ.

Реактивы:

1. Na-p-глицерофосфатный буфер — 100 мМ раствор, рН 8,2, содержащий 100 мМ 2-меркаптоэтанол (добавляют перед использованием); рН буфера доводят 2 М трисом до 8,2.

2. Na-fJ-глицерофосфатный буфер — 50 мМ раствор, содержащий 50 мМ 2-меркаптоэтанол, рН 7,0.

3. Фосфорилаза Ь 30—50 мг/мл.

4. Mg(CH3COOH)2-4H20 60 мМ — АТФ 18 мМ.

5. СНзСООН — 1 н. раствор.

6. NaCl — 5 М раствор.

Растворы готовят на бидистиллированной воде.

В состав реакционной смеси в расчете на 1 мл входят: 50 мМ Na-fJ-глицерофосфатный буфер (рН 8,2), содержащий 50 мМ 2-меркаптоэтанол, 30—50 мг/мл фосфорилазы Ь, 0,1—0,2 мг киназы фосфорилазы. Реакцию начинают добавлением Mg2+ и АТФ до конечной концентрации 10 и 3 мМ соответственно. Инкубацию проводят 45 мин при 30° С, после чего смесь охлаждают на льду, доводят рН до 7,0 добавлением охлажденной 1 н. СН3СООН. При охлаждении фосфорилаза а кристаллизуется. Для перекристаллизации осадок отделяют

центрифугированием, суспендируют в 50 мМ Na-p-глицерофосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 50 мМ 2-меркаптоэтанол; растворяют осадок добавлением 0,1 объема 5 М NaCl. Нерастворившийся белок удаляют центрифугированием. Супернатант ставят на диализ против того же буфера, но без NaCl. После удаления NaCl происходит кристаллизация фосфорилазы а. Для дополнительной очистки фермента повторяют перекристаллизацию еще 2—3 раза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Вульфсон П. Л. Молекулярные свойства и регуляция ферментативной активности киназы фосфорилазы//Молекулярные основы действия ферментов/Под ред. С. Е. Северина, Е. А. Кочетова. М., 1985. С. 54.

2. Chan K.-F., Graves D. J. Molecular properties of Phosphoryiase Kinase, N. Y.// //Calcium and cell function/Ed. W. Y. Cheung. 1984. Vol. 5. P. 1.

3. Malencik D. A., Fischer E. H. Structure, function and regulation of Phosphoryiase Kinase, N. Y.//Calcium and cell function/Ed. W. Y. Cheung. 1982. Vol. 3. P. 161.

4. Cohen P. Phosphoryiase Kinase from rabbit skeletal muscle, N. Y.//Methods irt Enzymology/Eds. S. P. Colowick., N. O. Kaplan. 1983. Vol. 99, P. 243.

5. ФОСФОГЛЮКОМУТАЗА

(а-В-глюкозо-1,6-дифосфат: a

страница 114
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
компьютерные курсы в москве недорого цены
парктроник parkmaster 4-dj-35
полотенцесушитель 30 см
шкафчики для раздевалок в офис

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)