химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ед/мг).

6. Реактивы для определения неорганического фосфата (с. 33).

7. Реактивы для определения концентрации белка методом Лоури (с. 81).

ь реакционную смесь (объем 1 мл) добавляют компоненты ферментативной реакции (указаны конечные концентрации) в следующей последовательности: буферный раствор (30 мМ), рН 6,8, содержащий 10 мМ 2-меркаптоэтанол, гликоген (1%), фосфорилазу (0,3 ед.), AMP — 1 мМ: преинкубируют 5 мин при 30° С, после чего реакцию начинают добавлением глюкозо-1-фосфата (25 мМ). В различные промежутки времени отбирают пробы (по 0,2 мл) для определения неорганического фосфата (с. 33). Контрольную пробу, в которую не добавляют АМФ, инкубируют в тех же условиях и используют для внесения поправки на присутствие следов фосфорилазы а в препарате фосфорилазы Ь и неорганического фосфата в реактивах.

Определение активности фосфорилазы а проводят в тех же условиях, но в реакционную смесь не добавляют АМФ.

Определение белка. Для определения концентрации белка методом Лоури необходимо предварительно осадить его трихлоруксусной кислотой (с. 81). Спектрофотометрическое измерение можно проводить при условии, когда из раствора фосфорилазы удален АМФ, при этом отношение A^mlMm равно 0,52—0,55; для расчета используют коэффициент А10/о1см= 13,2 при 280 нм.

Выделение гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика

Реактивы:

1. ЭДТА — 0,15 мМ раствор, рН, 7,0.

2. СН3СООН — 1 н. раствор.

3. КНС03 — сухой (перекристаллизованный).

4. NH4(S04)2 — насыщенный раствор, приготовленный при комнатной температуре из соли, перекристаллизованной в присутствии ЭДТА (рН раствора доводят аммиаком до 7,0).

5. Трис-HCl — 1 мМ раствор, рН 7,5.

6. Трис-HCl — 2 М раствор.

7. 1-цистеин-0,3 М раствор, рН 6,8 (готовить перед употреблением). Вместо L-цистеина можно использовать 2-меркаптоэтанол.

8. Аммиак.

9. Mg(CH3C00H)2-4H20 — 1 М раствор.

10. АМФ — 0,1 М раствор, рН 7,0.

11. Na-p-глицерофосфат — 60 мМ раствор, рН 6,8.

Растворы готовят на бидистиллированной воде. Экстракцию проводят при комнатной температуре; все остальные этапы работы можно проводить при комнатной температуре, используя сосуд со льдом, или в холодной комнате при 0—5° С.

Получение материала и экстракция. Кролика анестезируют введением в ушную вену раствора нембутала (60 мг/мл, 4—5 мл на кролика весом 3—4 кг). Через 5—10 мин вскрывают яремную вену и спускают кровь. Мышцы спины и задних конечностей быстро вырезают, помещают на охлажденную льдом фарфоровую чашку, освобождают от жира и сухожилий, измельчают в мясорубке, взвешивают и заливают равным объемом 0,15 мМ ЭТДА, рН 7,0. Тщательно перемешивают в течение 10 мин и отжимают через двойной слой марли. Экстракцию повторяют еще дважды, используя в начале равный объем и затем 0,5 объема раствора ЭДТА. Объединенный раствор фильтруют через стекловату и помещают в лед.

рН-осаждение. К экстракту медленно при перемешивании добавляют 1 н. СНзСООН (охлажденную на льду) до рН 5,1—5,2. Через 5 мин помутневший раствор центрифугируют при 1300 45 мин при 3—4° С. Супернатант фильтруют через складчатый бумажный фильтр, осадок отбрасывают. Прозрачный супернатант доводят до рН 6,8 добавлением КНСОз (сухого).

Фракционирование сульфатом аммония. К раствору медленно, при перемешивании на магнитной мешалке добавляют насыщенный раствор (NH4)2S04, рН 7,0 (700 мл/л) до насыщения 41%. На следующий день осадок отделяют центрифугированием (10 000 об/мин). Супернатант отбрасывают, осадок растворяют в небольшом объеме ?,15 мМ раствора ЭДТА, рН 7,0 при 25° С. Раствор белка подвергают диализу в течение ночи против дважды сменяемого 1 мМ раствора трис-HCl, рН 7,5 (4—5 л).

Тепловая обработка. К полученному после диализа раствору белка (измеряют объем) добавляют: L-цистеин (или 2-меркаптоэтанол) до 0,03 М концентрации, ЭДТА — до 0,5 мМ и 2 М раствором триса доводят рН до 7,5. Инкубируют при 37° С в течение 30 мин в термостатированной бане, затем раствор охлаждают до 25° С и центрифугируют при комнатной температуре. Осадок отбрасывают, а рН супер-натанта увеличивают до 8,2, добавлением 2 М раствора триса, инкубируют в тех же условиях. К охлажденному до 25° С белковому раствору добавляют 1 н. СНзСООН до рН 7,0. В случае образования мути раствор центрифугируют, осадок отбрасывают.

Кристаллизация. Раствор белка охлаждают (можно использовать охлаждающую смесь: NaCl со льдом). К охлажденному до 0° С раствору добавляют АМФ и Mg(CH3COOH)2 до конечной концентрации, соответственно равной 0,001 и 0,01 М. Кристаллизация фосфорилазы Ь начинается через 15—20 мин (иногда через 1—2 ч). Для более полной кристаллизации раствор фермента оставляют на ночь при 0—4° С. На следующий день суспензию центрифугируют (15000g, 15—20 мин лри 0—4° С), осадок растворяют в 30 мМ Na-p-глицерофосфате, рН 6,8, содержащем 30 мМ L-цистеин (или 2-меркаптоэтанол) при 30° С. Нерастворившийся белок отделяют центрифугированием и отбрасывают. К супернатанту вновь добавляют АМФ и Mg (СНзСООН) 2 в той же концентрации.

Дальнейшая очистка фермента может п

страница 112
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
аренда звукового оборудования для магазина
Рекомендуем фирму Ренесанс - мир лестниц.ру - качественно и быстро!
кресло руководителя ch 993
Супермаркет техники KNSneva.ru предлагает WS-C3560CX-12TC-S - КНС СПБ - мы дорожим каждым клиентом!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)