химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

х определяют содержание белка и активность гексокиназы, отбирают фракции с наибольшей активностью. На этой стадии можно закончить очистку фермента. Полученный раствор белка содержит два различных изозима дрожжевой гексокиназы. Белок можно осадить сульфатом аммония (насыщение 0,55), после чего поставить на диализ и высушить лиофилизацией.

Для разделения двух изозимов следует провести дополнительное фракционирование белка с использованием хроматографии на КМ-целлюлозе и повторно — на ДЭАЭ-целлюлозе.

Хроматография на КМ-целлюлозе. Соединяют фракции, обладающие ферментативной активностью, концентрируют с помощью ультрафильтрации диализуют против ацетатного буфера, рН 5,0 (реактив № 3).

КМ-целлюлозу подготавливают в соответствии с инструкцией (с. 109). Колонку размером 1,4x15 см уравновешивают тем же буфеП 1 ft

ром. На колонку наслаивают раствор белка (очень осторожно, чтобы не повредить верхний слой). Когда раствор белка войдет в ионообмен-иик, через колонку пропускают ацетатный буфер (реактив № 3) в количестве 1—2 объемов колонки для удаления несвязавшихся с КМ-целлюлозой белков. Затем пропускают буфер рН 5,0, содержащий 0—0,4 М NaCl. Скорость элюции — 20 мл/ч. Собирают фракции по 4 мл. Элюат концентрируют с помощью ультрафильтрации и ставят на диализ против буфера (реактив № 2).

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе; рН-градиентная элюция. На ^колонку размером 1,2X27 см, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером (реактив № 2), наносят раствор белка. Элюцию проводят в градиенте рИ, используя 150 мл буфера (реактив № 2) в смешивающем сосуде, и 150 мл буфера (реактив № 4) во втором сосуде. На колонку можно нанести примерно 10 мг белка. Скорость элюции — 20 мл/ч. Собирают фракции по 4 мл. В процессе хроматографии рН изменяется от 7,0 до 5,0. Первым (после выхода из колонки примерно 100 мл раствора) выходит изозим I и вслед за ним — белок, соответствующий изозиму II.

ЛИТЕРАТУРА

J.Colo wick S. P. The Hexokinases. N. Y.//The Enzymes/Ed. P. D. Boyer. 3 rd

edn. 1973. Vol. 9. P. 1. 2. В a r n a r d E. A. Hexokinases from yeast. N. Y.//Methods in Enzymology/Ed.

W. A. Wood. 1975. Vol. 42C. P. 6. -3. Purich D. et al. The Hexokinases: kinetic, physical and regulatory properties.

N Y.//Adv. Enzymology/Ed. A. Meyster. 1973. Vol. 39. P. 249. 4 Mereno F et al. Hexokinase P II from Saccharomyces cervisial is regulated by

changes in the cytosolic Mg2+-free ATP concentration//Eur. J. Biochem. 1986.

Vol. 161 P. 565.5. M a i t r a P., Hobo Z. Molecular properties of yeast Glucokinase//Mol. Cell Biochem. 1977. Vol. 18, N I. P. 21.

2. ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗА

(а-1,4-глюкан: ортофосфат-глюкозия-трансфераза, КФ 2.4.1.1)

Гликогенфосфорилаза катализирует реакцию фосфоролитического расщепления а-1,4-гликозидной связи в молекуле гликогена, в результате которой отщепляется концевой нередуцирующий остаток глюкозы с образованием глюкозо-1-фосфата. Реакция обратима

(AG0' = +0,73 ккал).

В скелетной мускулатуре фосфорилаза находится в двух формах: b и а. Активность фосфорилазы Ь можно определить только в присутствии АМФ; фосфорилаза а активна в отсутствие АМФ. Для обеих форм фермента АМФ является положительным аллостерическим эффектором. Молекула фосфорилазы Ь представляет собой димер, фосфорилазы а — тетрамер. Молекулярная масса субъединицы фермента равна 97 400 Да. Обе формы фермента могут находиться в состоянии равновесия между димерными и тетрамерными молекулами. На переход димеров в тетрамеры и обратно оказывают влияние компоненты ферментативной реакции, активаторы, ингибиторы, а также рН, ионная сила раствора, температура и др. Наиболее активными являются димеры обеих форм. Взаимопревращение фосфорилазы Ь и фосфорилазы а осуществляется ферментативно с помощью киназы фосфорилаВеличины 50,5 фосфорилазы а и Ь для трех субстратов соответственно равны: для фосфата — 2 и 10 мМ, для глюкозо-1-фосфата — 2—3 и 4—6 мМ; для гликогена — 0,04 и 0,2 мМ; константа активации для АМФ: 0,002—0,005 мМ для фосфорилазы а и 0,05— 0,2 мМ для фосфорилазы Ь. По отношению к ингибиторам известны следующие кинетические параметры: Ki для глюкозо-6-фосфата — 0,9—1,0 мМ (в случае фосфорилазы Ь) и 6,0 мМ (в случае фосфорилазы a); Kt для глюкозы — 2 мМ. Условия определения активности фермента: буфер, рН 6,8, инкубация при 30° С.

Определение активности фосфорилазы b и а

Определение активности фермента проводят по реакции синтеза гликогена:

фосфорилаза

(глюкоза)„ + глюкозо-1-фосфат ( —*~ (глюкоза),г-и + Н3Р04.

Метод основан на измерении количества неорганического фосфора, образующегося в результате переноса остатка глюкозы от глюкозо-1-фосфата на гликоген.

Реактивы:

1. Na-p-глицерофосфатный буфер — 60 мМ раствор, рН 6,8 (можно использовать имидазональный или глицил-глициновый буфер), содержащий 20 мМ 2-меркаптоэтанол (добавляют перед использованием).

2. Гликоген — 2%-ный раствор.

3. Глюкозо-1-фосфат— 100 мМ раствор, рН 6,8.

4. АМФ — 0,05 М раствор, рН 7,0.

5. Фосфорилаза b (удельная активность 30—40

страница 111
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
боксы для хранения вещей в москве
вао курсы ландшафтного дизайна для начинающих
коды ошибок холодильника хайер
nike prime hype df купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)