химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

каждая. В качестве субстрата реакции дрожжевая гексокиназа способна использовать не только а-?>-глюкозу, но и а-Л-ман-нозу и a-D-фруктозу. Димеры гексокиназы могут диссоциировать на активные мономеры. При низкой концентрации белка, высокой ионной силе, а также в присутствии субстратов равновесие димеры мономер сдвигается в сторону мономера. Считают, что главную роль в метаболизме углеводов дрожжей играет изозим II. В регуляции его активности принимает участие нуклеотидный субстрат. При постоянной концентрации ионов Mg2+ и высокой концентрации АТФ наблюдается ин-гибирование фермента, при этом уменьшается максимальная скорость реакции и увеличивается константа Михаэлиса для Mg—АТФ. рН-Оп-тимум активности фермента при рН 7,5. Константа Михаэлиса для а-?>-глюкозы — Ю-4 М.

Определение активности гексокиназы

Активность гексокиназы определяют энзиматическим методом. В качестве сопрягающего фермента в реакционную среду добавляют дегидрогеназу глюкозо-6-фосфата и НАДФ. Ферментативную реакцию

01й

регистрируют по нарастанию оптической плотности при 340 нм (см. с. 7).

a-D-глкжоза -f Mg—АТФ гексокиназа^ глюкозо-6-фосфат + Mg—АДФ

дегидрогеназа глюкозо б фосфата-, НАДФ +

6-фосфоглюконо-б-лактон I

6-фосфоглюконат -f НАДФН + Н ^

Реактивы:

1. Трис-HCl — 40 мМ раствор, рН 7,5.

2. a-D-глюкоза — 0,3 М раствор.

3. MgCl2 — 0,2 М раствор.

4. АТФ — 15 мМ раствор, рН 7,5.

5. НАДФ+ — 18 мМ раствор, рН 6,5.

6. Дегидрогеназа глюкозо-6-фосфата (кристаллический препарат).

7. Гексокиназа.

Ферменты разводят на трис-HCl буфере непосредственно перед определением ферментативной активности. Растворы ферментов, АТФ, НАДФ до внесения в реакционную смесь хранят на льду.

В спектрофотометрическую кювету вносят следующие компоненты реакционной среды (указаны конечные концентрации): 30 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, 10 мМ глюкозу, 15 мМ MgCl2, 2,5 мМ АТФ, 0,6 мМ НАДФ+, 2 ед/мл дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата. Преинку-бируют 3—5 мин, после чего начинают реакцию добавлением фермента (или субстрата) в объеме 20—30 мкл.

Определение белка. Для определения белка используют метод Лоури (с. 81). При спектрофотометрическом измерении определяют оптическую плотность при 280 нм и рассчитывают концентрацию с помощью коэффициента Л1См1%=9,0.

Выделение гексокиназы из пекарских дрожжей

Реактивы:

1. Пекарские дрожжи — 1 кг.

2. Фосфатный буфер, рН 7,0 (ионная сила 0,1).

Состав буфера: КН2Р04 — 2,8 г; К2НР04-ЗН20 — 4,6 г; ?>-( + ) -глюкоза — 5 г; ЭДТА — 0,37 г; Н20 — до 1 л.

3. Ацетатный буфер 0,02 М, рН 5,0 (ионная сила — 0,013). Состав

буфера: СН3СООН ледяная — 0,4 мл; CH3COONa (безводный) — 1,1 г; ?>-( + )-глюкоза — 5 г; ЭДТА — 0,37 г; Н20

до 1 л.

4. Ацетатный буфер, рН 4,5 (ионная сила 0,05). Состав буфера: СН3СООН ледяная — 4,3 мл; CH3COONa (безводный) — 4,3 г; D(+)-глюкоза — 5 г; ЭДТА — 0,37 г; Н20 до 1 л.

5. ?)-( + ) -глюкоза.

6. ЭДТА.

7. Na2HP04 — 0,2 M раствор, приготовленный на 1 мМ ЭДТА.

8. СНзСООН — 3 н. раствор.

9. (NH4)2S04 — сухой порошок, перекристаллизованный из раствора ЭДТА (1,5 г на 1 л).

10. ДЭАЭ-целлюлоза.

11. КМ-целлюлоза.

12. КО — 0,3 М раствор.

13. NaCl — 0,4 М раствор.

*

Высушивание дрожжей и экстракция. Пекарские дрожжи высушивают при комнатной температуре. Из 1 кг дрожжей получают 200 г сухого порошка. Высушенные дрожжи измельчают в ступке и 100 г порошка суспендируют в 400 мл 0,2 М Na2HP04, содержащего 1 мМ ЭДТА, смесь инкубируют 3 ч при 37° С, после чего центрифугируют при 0° С 30 мин (5000 g).

рН-Осаждение. Супернатант помещают в ледяную баню и добавляют небольшими порциями 3 н. СНзСООН при постоянном перемешивании, рН раствора доводят до 4,5 (эту процедуру проводят в течение 1,5—2 ч). Раствор оставляют при 4° С на ночь. На следующий день центрифугируют 20 мин при 10 000 g.

Фракционирование сульфатом аммония. Супернатант, полученный на предыдущей стадии, доводят сухим сульфатом аммония до насыщения 0,39 (24 г на 10 мл). Через час центрифугируют, осадок отбрасывают. В супернатанте увеличивают насыщение до 0,55 (10 г (NH4)2S04 на 100 мл). Раствор центрифугируют 30 мин при 15 000 g. Осадок растворяют в 20 мл фосфатного буфера рН 7,0, и полученный раствор ставят на диализ против 1 л того же буфера. Во время диализа буфер меняют 2—3 раза. Осадок, выпавший во время диализа, удаляют.

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. ДЭАЭ-целлюлозу подготавливают в соответствии с инструкцией (с. 109), заполняют колонку (3X25 см) и уравновешивают буфером (реактив № 2). Наносят раствор белка и проводят элюцию в линейном градиенте того же буфера, содержащего 0—0,3 М КС1. Скорость элюции — 90 мл/ч. Собирают фракции по 9 мл, определяют в них содержание белка и ферментативную активность. Фракции, в которых обнаружена активность гексокиназы, объединяют и проводят повторную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Для этого подготавливают колонку размером 1,4X15 см. Белок элюируют буфером (реактив 2) (около 200 мл), содержащим 0—0,3 М КС1. Скорость элюции — 35 мл/ч. Собирают фракции по 4 мл, в которы

страница 110
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
аренда мультимедийного
Рекомендуем компанию Ренесанс - чердачная лестница ножничного типа - цена ниже, качество выше!
кресло 808
склад для хранения вещей москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)