химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

дит в результате денатурации части фермента. Чем короче время инкубации, тем выше кажущийся температурный оптимум. На рис. 32 видно, что при времени реакции t\ активность ^ максимальна при 70° С, а при времени t2— || при 50° С. Оптимальная температура дейст- |^ вия фермента зависит от соотношения между § §_ влиянием температуры на скорость фермен- * ^ гативной реакции, с одной стороны, и на

скорость денатурации фермента — с другой. „ „„ т, ,

тх , , Рис 32. Кривые хода ферИз сказанного ясно, что для исследования меНтативнои реакции при

влияния температуры на собственно фермен- различных значениях темпегативную реакцию необходимо подобрать ус- ратуры. Объяснение в текловия, обеспечивающие сохранение нативной сте

структуры белка. Затем определяют зависимость различных кинетических параметров фермента от температуры.

7. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНГИБИТОРОВ

Ингибиторы, специфически взаимодействующие с ферментами, делятся на две группы — необратимые и обратимые. Действие необратимых ингибиторов можно наблюдать, блокируя функционально важные группы ферментов (например, модифицируя SH-группы йодаце-татом).

Для изучения структуры активных и регуляторных центров широко применяют химические аналоги субстратов, коферментов, эффекторов, способных стехиометрически и необратимо ингибировать фермент. Кинетический анализ полученных данных проводят методом Китца и Вильсона, основанным на предположении, что взаимодействие фермента с ингибитором протекает по следующей схеме.

Е + 1-г^-*Е...1^±-2-»Е1.

где k-ifk+i — константа диссоциации (/С,) обратимого фермент-инги-биторного комплекса (E...I), k+2 — константа скорости необратимой модификации фермента. Зависимость между кинетическими константами и концентрацией ингибитора выражается уравнением прямой в координатах 1//гКаж от 1//:

L_ = _l L_

Кажущуюся константу скорости (или константу скорости реакции псевдопервого порядка kKam) определяют из экспериментальных данных (рис. 33) Величины Kt и k+2 рассчитывают из вторичного графика, представленного на рис. 34.

Обратимое ингибирование характеризуется равновесием между ферментом и ингибитором Константа равновесия (Ki) служит мерой их сродства. Обратимые ингибиторы, действие которых приводит к увеличению эффективной Кт> называют конкурентными. Неконкурентные ингибиторы не влияют на величину Кт, но уменьшают максимальную скорость. Существуют ингибиторы, изменяющие как Кт, так и У. В случае конкурентного ингибирования

<-> 1 о

Кг, — Кт 1

Величину Ki можно определить методом Лайнуивера и Бэрка по длине отрезка, отсекаемого на оси абсцисс и равного IjKp, где

[I]

(рис. 35, Л).

Кг

Разделив обе части уравнения на Кт, получим

К

к

т

где I — концентрация ингибитора, К? — кажущаяся константа Ми-хаэлиса в присутствии ингибитора.

Рис 35 График Лайнуивера—Бэрка для конкурентного (А) и неконкурентного (Б)

ингибирования 1 — без ингибитора, 2 и 3 — в присутствии ингибитора

При неконкурентном ингибировании

{Km + S)(l Kt)'

На графике Лайнуивера—Бэрка точка пересечения с осью ординат

дает величину \/Vp (Vp ~ величина V, наблюдаемая в присутствии

ингибитора).

V„ = (рис. 35, Б).

Отсюда

к,= и

(V/Vp-l)

Для определения типа ингибирования и величины Kt широко используется метод Диксона Скорость реакции измеряют при варьирующей концентрации ингибитора и постоянной концентрации субстрата. График зависимости l/v0 от [I] представляет собой прямую Если

получить еще ряд экспериментальных точек при другой концентрации: субстрата, прямые пересекутся в точке — К, при конкурентном ингиби-ровании. Графики Диксона для конкурентного и неконкурентного ингибирования показаны на рис. 36, А и

8. ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Влияние рН на стабильность фер-' мента. Готовят серию пробирок, в каждую из которых помещают буферный раствор с определенным рН (учитывают чувствительность фермента к ионам различной природы) и одинаковое количество фермента. Выдерживают .пробы в течение определенного времени при фиксированной температуре, после чего отбирают из. каждой пробы определенный объем раРис 36. Графическое определение констант ингибирования для конкурентного {А) и не-конкурентного (Б) ингибиторов методом Диксона

1, 2 и 3 — разные концентрации субстрата^ Si — насыщающая концентрация (52>53)

створа и помещают его в стандартную смесь для определения активности (при фиксированном значении рН, оптимальном для активности). Эксперимент следует ставить таким образом, чтобы время преинкуба-ции при каждой величине рН было одинаковым. Для этого инкубацию серии проб при различных рН начинают не одновременно, а с интервалом 2—3 мин (это позволит провести определение активности в первой пробе до того, как истечет время преинкубации во второй и т. д.)_ Необходимо обеспечить условия, при которых внесение пробы в реакционную смесь для измерения активности не изменило бы рН этой смеси.

Влияние температуры на стабильность ферментов. Фермент (концентрация его в пробе может варьир

страница 108
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
мебель для слесарных мастерских
Автокресла группа 1 (9-18 кг) Koochi купить
узел смесительный supr 80-6.3
сковорода вок zwilling

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.02.2017)