химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

одним из субстратов изучаемой реакции, либо самим ферментом. Такая постановка позволяет предварительно выявить возможность протекания побочных реакций. Кроме того, присутствие системы сопряжения в среде инкубации до начала реакции обеспечит «плавную» регистрацию образующегося продукта.

Таким образом, количество сопрягающего фермента можно подобрать экспериментально. Его можно также рассчитать, зная кинетические параметры системы. Она должна находиться в стационарном состоянии, когда скорость реакции, катализируемая индикаторным ферментом, равна скорости реакции, осуществляемой тем ферментом, активность которого исследуется. Расчеты, проведенные для ситуации, при которой через 1 мин после запуска реакции достигается 98% истинной скорости, показывают, что количество сопрягающего фермента может быть определено из соотношения:

Величина V, выраженная в мкмоль-мл"1-мин-1, •— это число единиц вспомогательного фермента в 1 мл раствора; Ктр — константа Миха-элиса для продукта (р) реакции, катализируемой определяемым ферментом. С учетом ряда поправок минимальным считают количество сопрягающего фермента, равное ЪКт. При этом следует иметь в виду, что величины Кт и V относятся к условиям, в которых проводят тестирование (они могут отличаться от величин, определяемых в оптимальных для сопрягающего фермента условиях).

Соотношение V = 5Km справедливо для случая, при котором стационарное состояние достигается через 1 мин после начала реакции; если требуется более короткое время, количество сопрягающего фермента следует увеличить. Так, для интервала времени 10 с V=30Kpm. Анализ более сложных случаев (использование нескольких сопрягающих ферментов) и подробные расчеты приведены в книге Р. Скоупса (см. список литературы, с. 216).

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА

1

Проводят серию измерений начальной скорости реакции в стандартных условиях, изменяя концентрацию субстрата (либо одного из

субстратов) при насыщающих концентn№ewa_p_cj10 Km. Количество экспериментальных точек, соответствующих разным концентрациям субстрата, должно быть не менее 6—7. Получают зависимость i>o от [S], показанную на рис. 28.

Для более точного определения величины V (которое трудно осуществить экспериментально) используют линейные преобразования, уравнения Михаэли-са — Ментен, предложенные Лайнуиве-ром—Бэрком, Иди—Хофсти и др. В соответствии с указанными уравнениями строят графики, представленные на рис. 29 и 30:

1 ^ Кт , 1 . v V[S] V '

[S]

Весьма удобным является метод, предложенный Эйзенталем и Корниш—Боуденом, в котором на графике откладываются не обратРис. 30. График Иди—Хофсти. Определение величин Кт и V

Рис. 29. График Лайнуивера— Бэрка. Определение величины константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции (Кт и V)

ные величины, а значения [S] и соответствующие им величины v0. Уравнение Михаэлиса—Ментен преобразуется следующим образом:

V Кгп_= !

v [S]

Эта зависимость выражается графически, как показано на рис. 31. Экспериментальные данные обрабатывают, используя указанные графические способы. Определяют величины Кт и К В случае двух- и трехсубстратных реакций определяют Кт Для разных субстратов. По найденным величинам V" рассчитывают удельную активность препарата фермента.

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ ОТ рН

(Vohfah -/*-/-/—>

Так как величины Km и V могут по-разному зависеть от рН, исследование, проводимое при ненасыщающих концентрациях субстрата,, дает информацию, которую трудно интерпретировать. Поэтому необходима постановка экспериментов по определению влияния рН на Km. и V. Следует помнить, что концентрация субстрата, являющаяся насыщающей при одном значении рН, при другом может йе быть ею. Выбирая буфер, нужно учитывать, чтобы его рК был по возможности близок к оптимуму рН реакции, а также иметь в виду, что при одном и том же рН в разных буферах каталитическая активность может различаться. Отдельные ионы могут оказывать активирующее или ингибирующее влияние на фермент. Поливалентные анионы (фосфат, сульфат, цитрат) могут конкурировать с отрицательно заряженным субстратом, вызывая ингибирование реакции. Отдельные компоненты буфера, например ЭДТА, гистидин, цитрат, могут связывать ионы металлов, важные для активности некоторых ферментов. Следует иметь в виду, что ионная сила раствора оказывает влияние на активность фермента. Поэтому, изменяя состав реакционной среды, необходимо обеспечивать постоянство ионной силы.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ

Скорость ферментативной реакции повышается в 1,5—2,2 раза с повышением температуры на 10° С. Поэтому такого понятия, как «температурный оптимум активности», не существует. Вместе с тем в условиях эксперимента существует определенное значение температуры, при котором активность фермента максимальна; дальнейшее увеличение температуры приводит к снижению скорости реакции. Следует иметь в виду, что это происхо

страница 107
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
качественный облицовочный кирпич
светильник направление эвакуации
матрос для дивана
афиша фестиваль 2017

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.07.2017)