химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

продуктами реакции; изменением

исходных условий, например снижением ^ состояние раднобеш рН в ходе реакции; инактивацией фермента и др.

Скорость реакции в любой момент

времени (рис. 27) определяется как

тангенс угла наклона касательной к кривой. Начальная скорость — это тангенс

угла наклона касательной к кривой в нулевой точке. Однако проведение такой " §вемя тн

касательной не обеспечивает достаточной '

точности определения начальной скоро- _ „„ v

сти, поэтому выбирают эксперименталь- ^VM^SSbT.

ные услтэвия, при которых измерения тексте

можно проводить на начальном участке кривой, имеющем линейный

характер. Это может быть достигнуто снижением концентрации фермента либо увеличением чувствительности прибора.

„— ^^иинпд ч-ьпнсп!дшвHUИ АКШВНОСТИ

Методы измерения активности ферментов делят на две группы: одни основаны на остановке реакции через определенные промежутки времени, в других прирост продукта или убыль субстрата регистрируются непрерывно.

В первом случае возможны два варианта: а) из реакционной среды периодически отбирают пробы, в которых (в строго фиксированные интервалы времени) реакция останавливается путем быстрой инактивации фермента; б) готовят серию параллельных проб, останавливая реакцию в них через различные интервалы времени.

Методы непрерывной регистрации ферментативной активности часто основаны на том, что в ходе реакции происходит убыль или нарастание количества вещества, обладающего характерными спектральными свойствами. Таким образом измеряют активность дегидрогеназ, использующих НАДН и НАДФН (с. 7).

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ В СИСТЕМЕ СОПРЯЖЕННЫХ РЕАКЦИЙ

Широкое распространение приобрели методы определения активности с использованием вспомогательных ферментов. Они основаны на том, что продукт изучаемой реакции служит субстратом вспомогательного фермента. Этот метод имеет особое преимущество в тех случаях, когда непрерывная регистрация скорости изучаемой реакции затруднена или когда продукт реакции является ингибитором исследуемого фермента.

В качестве сопрягающих ферментов часто используют дегидроге-назы и их коферменты в окисленной или восстановленной форме. Например, активность гексокиназы определяют в системе, содержащей дегидрогеназы глюкозо-б-фосфата и НАДФ. Скорость восстановления НАДФ соответствует скорости гексокиназной реакции. Иногда используют системы двойного или тройного сопряжения, однако конечным звеном такой системы является соответствующая дегидрогеназа (например, при определении активности фосфофруктокиназы, креатин-киназы). При определении активности в сопряженной системе следует учитывать ряд условий.

Во-первых, сопрягающий фермент не должен лимитировать скорость изучаемой реакции. Практически 30-кратный избыток его по отношению к активности изучаемого фермента обеспечивает достаточно быстрое превращение образующегося продукта. Чтобы убедиться в правильности выбранных количеств сопрягающего фермента, полезно провести сравнительное определение активности с большим и меньшим (в 4 раза) количеством. Если скорость изучаемого фермента при этом не изменяется, сопрягающая система подобрана правильно. Удобно изучать скорость реакции, когда добавленное количество вспомогательного фермента обеспечивает изменение оптической плотности на 0,03—0,20 в минуту.

Во-вторых, сопрягающий фермент должен обладать высоким сродством по отношению к своему субстрату, т. е. продукту изучаемой реакции. Необходимо проверить, не содержит ли препарат сопрягающего фермента примесь исследуемого. Для этого добавляют в контрольную пробу все компоненты реакции, кроме фермента, активность.

которого измеряют. Если определяемый фермент отсутствует в качестве примеси, реакция не идет (оптическая плотность не изменяется).

В-третьих, в реакционной среде, содержащей пиридиновые нукле-отиды, может происходить неспецифическое изменение оптической плотности. Чтобы выяснить, не связано ли оно с неустойчивостью ко-фермента, в контрольной пробе, не содержащей один из субстратов реакции, определяют его количество.

В-четвертых, присутствие в среде инкубации соединений, необходимых для полноценной работы сопрягающей системы (субстрат, кофакторы, активаторы), может существенно сказаться на скорости изучаемой реакции. Чтобы исключить такую возможность, проводят предварительные эксперименты, где процессы образования продукта реакции и его определения разобщены. С этой целью применяют метод отбора проб: проводят изучаемую реакцию в отсутствие компонентов сопрягающей системы, останавливают реакцию, и накопившийся продукт реакции определяют количественно уже с помощью сопрягающей системы. В пробу, содержащую все компоненты сопрягающей системы, вносят порцию определяемого продукта, и реакцию, катализируемую сопрягающим ферментом, доводят до конца, т. е. до прекращения регистрируемых изменений оптической плотности.

В-пятых, при определении активности ферментов с помощью сопрягающих систем реакцию удобно начинать либо

страница 106
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
http://help-holodilnik.ru/remont_model_4226.html
HP 15-ay504ur
руслан и людмила купить билеты авербух
кровать двуспальная с мягким изголовьем купить дешево

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.09.2017)