химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

оты. Если фермент имеет высокую удельную активность, можно использовать суспензию и не центрифугируя, так как в данном случае ее-сильно разводят и сульфат аммония оказывается в столь низкой концентрации, что не влияет на энзиматическую реакцию.

Другой способ хранения — в замороженном состоянии (при температуре ниже —25° С). Перед замораживаем ферментный раствор» разливают по отдельным пробиркам, чтобы каждую порцию подвергать замораживанию и оттаиванию только один раз.

3. ВЫРАЖЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Единицы активности. Согласно рекомендации комиссии по ферментам Международного биохимического союза за единицу активности фермента (Е) принимают то его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту при заданных условиях определения. Рекомендуемая температура 30° С (или указывают фактическую температуру, при которой проводилось определение). Остальные условия (рН, концентрация субстрата, кофакторов и др.) должны быть оптимальными. При бимолекулярной реакции А+Б = В + Г за единицу фермента принимают то его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль А или Б, или 2 мкмоль А, если Б = А, за 1 мин. Если фермент атакует более чем одну связь, например при действии-на полимерную молекулу, расчет ведется на 1 мк-экв затронутых реакцией групп.

Удельная активность выражается числом единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка. Молекулярная активность характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению одной молекулой фермента за 1 мин. Когда известно количество активных центров в молекуле фермента, вводится понятие активности каталитического центра. Она характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению за 1 мин при расчете на 1 каталитический центр.

II. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ

Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата (субстратов), рН, температуры, присутствия активаторов или ингибиторов, природы буфера, его ионной силы и др. Ряд факторов оказывает влияние на стабильность фермента, вызывая необратимые-изменения его нативной конформации. Это необходимо учитывать, подбирая условия измерения активности (рН, температура, время инкубации). Подробное исследование стабильности ферментов описано* ниже.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ

Если фермент подчиняется кинетике Михаэлиса—Ментен

VS

V — ,

Km + S

можно определить кинетические параметры реакции: константу Михаэлиса (Km) и максимальную скорость (V). В случае односубстратной реакции задача сводится к получению серии данных, характеризующих зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата, и к соответствующей графической обработке этих данных. В более часто встречающихся случаях двух- или трехсубстратной реакции.

эксперимент ставят таким образом, чтобы, меняя концентрацию одного из субстратов, обеспечить присутствие другого (других) в насыщающей концентрации. При этом необходимо иметь в виду, что концентрация одного из субстратов обычно влияет на Km другого и характер этого влияния зависит от механизма реакции. Например, в случае ферментов, действующих по механизму, «пинг-понг», увеличение концентрации одного субстрата вызывает рост Кт для другого.

Условия проведения ферментативной реакции. Прежде чем приступить к постановке кинетических экспериментов, необходимо выполнить ряд условий.

1. Подобрать концентрацию фермента, при которой скорость реакции была бы пропорциональна количеству добавленного белка-катализатора. Если подобная зависимость не наблюдается, это может указывать на присутствие в препарате фермента ингибитора либо активатора, а также на возможную диссоциацию фермента при разведении на субъединицы, обладающие иными кинетическими свойствами, чем олигомер.

2. Подобрать условия инкубации, при которых обеспечивалось бы постоянство всех параметров кроме того, который исследуется. Это значит, что в ходе эксперимента не должна изменяться температура. Изменение температуры может произойти, например, в тех случаях, когда инкубационная смесь не термостатирована, а эксперимент занимает длительное время либо когда отдельные компоненты реакционной среды, смешиваются в разных соотношениях, имеют неодинаковую температуру.

3'. Начинать реакцию следует внесением фермента или одного из субстратов, добавляемых в минимальном объеме при быстром перемешивании реакционной смеси. Это удобно делать с помощью специальных пластиковых палочек, уплощенных на конце. Одновременно отмечают начало реакции.

4. Обеспечить условия измерения начальной скорости реакции. Скорость ферментативной реакции, измеряемая по количеству превращенного субстрата или образовавшегося продукта реакции, со временем снижается. Это можно объяснить целым рядом причин: снижением степени насыщения фермента субстратом, который расходуется в процессе ферментативной реакции, так что концентрация его в системе уменьшается; увеличением скорости обратной реакции (если реакция обратима); возможным ингибированием фермента образующимися

страница 105
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ручка круглая скоба
урна пепельница для мусора уличные металлические
кровать 140 на 180
http://taxi-stolica.ru/contact/

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.08.2017)