химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ри адсорбции балластных белков и около 10% при адсорбции исследуемого фермента, считается оптимальным. На основании полученного соотношения рассчитывают количество геля, которое необходимо добавить на весь объем ферментного раствора.

В другом варианте ко всему объему ферментного раствора добавляют определенное (обычно небольшое) количество геля, перемешивают, центрифугируют и в центрифугате, не сливая его с осадка, а только отбирая нужный объем, измеряют ферментативную активность. Процедуру повторяют до тех пор, пока не будет достигнут нужный эффект.

Для адсорбции белков достаточно перемешать раствор после добавления геля до получения однородной суспензии. После центрифугирования осадок отбрасывают, если ставилась задача адсорбировать балластные белки. Если адсорбирован фермент, осадок геля промывают несколько раз водой или слабым буферным раствором (если это не сопровождается потерей фермента). Для элюции фермента используют слабощелочной буферный раствор более высокой концентрации, чем тот, что использовался при промывании геля. Если фермент элю-ируется плохо, в буфер для увеличения элюции добавляют соль.

Элюцию фермента с геля также проводят под контролем определения ферментативной активности. Для этого осадок геля 10—15 мин перемешивают с элюирующим буфером, центрифугируют и в надосадочной жидкости измеряют ферментативную активность. Обработку повторяют с новыми порциями буфера (но с меньшими объемами) до тех пор, пока не будет элюировано основное количество фермента.

С помощью избирательной адсорбции можно сконцентрировать ферментный раствор, если первоначальный объем его был большим, а концентрация фермента в нем невысока — элюция обычно осуществляется небольшим объемом.

Кристаллизация

Большое количество ферментов кристаллизуется из раствора сульфата аммония. Необходимым условием кристаллизации является достаточно высокая степень чистоты фермента и оптимальная концентрация его в растворе. Концентрации выше оптимальной также не способствуют получению фермента в кристаллическом виде. Один из способов кристаллизации фермента заключается в следующем. К раствору фермента определенной концентрации и при фиксированном значении рН медленно, при помешивании (удобно использовать магнитную мешалку) добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (предварительно доведенный до того же значения рН, что и ферментный раствор) до появления слабой мути 1 и оставляют в холодильнике на несколько дней. В ряде случаев в процессе стояния концентрацию сульфата аммония требуется постепенно повышать.

Наряду с использованием сульфата аммония существуют иные способы кристаллизации ферментов, например из раствора спирта (ал-когольдегидрогеназа печени), ацетона (уреаза) и др.

При кристаллизации в ряде случаев происходит увеличение удельной активности фермента или (и) освобождение от примесей сопутствующих ферментов. Поэтому данную стадию можно рассматривать как один из способов очистки энзимов.

Критерий чистоты ферментных препаратов

Для определения чистоты (или гомогенности) ферментных препаратов в настоящее время наиболее широко используются ультрацентрифугирование и диск-электрофорез. В основе первого из них лежит различная скорость седиментации в ультрацентрифуге белков с различной молекулярной массой (и различной формой молекул). Одним из ограничений данного метода является то, что разные белки могут иметь одну и ту же величину седиментации и не разделяться при ультрацентрифугировании. С другой стороны, белок в растворе может находиться в виде нескольких форм, различающихся по степени агрегации, а следовательно, и по молекулярной массе. Если эти формы не превращаются одна в другую или превращения осуществляются достаточно медленно, на седиментограмме обнаружится несколько пиков, что, однако, не будет свидетельствовать о наличии примесных белков в исследуемом препарате фермента. Недостатком метода является также его невысокая чувствительность, что не позволяет обнаруживать малые количества примесных белков.

Более высокой разрешающей способностью характеризуется метод диск-электрофореза, который не требует сложного и дорогостоящего оборудования и может быть воспроизведен в любой лаборатории (с. 94).

Для проверки однородности ферментного препарата недостаточно одного метода. Если примесь является ферментом с высокой удельной активностью, это может вызвать нежелательные осложнения при использовании ферментного препарата, например в аналитических целях. В таком случае ферментативный контроль на наличие побочных активностей совершенно необходим.

2. ХРАНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

1 Используют также диализ ферментного раствора против насыщенного раствора сульфата аммония, опять же до появления слабой мути.

Если фермент кристаллизуется (или осаждается) из раствора сульфата аммония, его хранят в этом растворе в виде суспензии; на холоде его каталитическая активность, как правило, остается практически неизменной достаточно долго. Перед работой часть суспензии центрифугируют, осадок растворяют в буфере и используют для раб

страница 104
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
прокат звукового оборудования в москве
Фирма Ренессанс гусиный шаг - доставка, монтаж.
стул самба сильвер
аренда боксов хранения

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)