химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

изкой температуры используют спиртовую (или ацетоновую) баню. Добавлением небольших кусочков сухого льда можно достичь желаемого охлаждения.

На рис. 26 изображена одна из возможных установок для фракционирования органическими растворителями. Ферментный раствор наливается в стеклянный стакан 3, помещенный в спиртовую баню 4. Уровень спирта после добавления органического растворителя должен несколько превышать уровень жидкости в стакане (определяют заранее)

2

Спиртовую баню ставят на магнитную мешалку или используют механическую мешалку (см. рис. 26). Стакан с ферментным раствором должен иметь ровное дно, в противном случае трудно добиться интенсивного и равномерного перемешивания, так как магнит мешалки будет постоянно сбиваться к стенкам стакана.

Органический растворитель, используемый для фракционирования, предварительно охлаждают до 0—минус 30° С (в зависимости от условий фракционирования) и помещают в делительную воронку 2. В такой же степени охлаждают и спирт в кожухе

В бане 4 доводят температуру примерно до —3° С. Ферментный раствор наливают в стакан 3, помещают его в спиртовую баню 4 и сразу же включают мешалку. По достижении температуры ферментного раствора 0° С начинают добавлять из сосуда 2 органический растворитель и следят за тем, чтобы он стекал тонкой струйкой по» стенке стакана, успевая перемешиваться с раствором, а не наслаивался бы на его поверхности.

Здесь следует отметить несколько моментов. При 0° С и ниже ферментный раствор может замерзнуть, поэтому нельзя сразу сильно понижать его температуру. С другой стороны, добавление органического растворителя сопровождается повышением температуры ферментного раствора, поэтому его следует приливать постепенно, особенно в самом начале, регулируя скорость его поступления так, чтобы раствор в стакане 3 не нагревался выше 0° С. По мере повышения концентрации органического растворителя температура замерзания раствора понижается и можно вести работу при более сильном охлаждении, что достигается добавлением в баню 4 нескольких кусочков сухого льда. Приливая новые порции органического растворителя, температуру в стакане постепенно понижают до нужного значения. При получении последующих фракций в ферментном растворе уже будет содержаться определенное количество органического растворителя, поэтому не будет и опасности замерзания раствора при минусовой температуре. Не будет происходить и его разогревания.

После добавления органического растворителя рекомендуется продолжать перемешивание еще 15—20 мин при температуре фракционирования. Образовавшиеся осадки отделяют центрифугированием при той же температуре. При более высокой температуре часть осадка может раствориться, а при более низкой часть белков из раствора может выпасть в осадок. Осадки обычно оседают легко, однако увеличение скорости центрифугирования даст возможность снизить его продолжительность. После центрифугирования осадок, содержащий фермент, необходимо растворить в воде или буфере, чтобы снизить концентрацию органического растворителя. Перед последующей обработкой для удаления органического растворителя проводят диализ или используют гель-фильтрацию.

Активность фермента на этой стадии измеряют только после растворения осадка. Высокие концентрации органического растворителя могут существенно искажать результаты.

Метод избирательной адсорбции

Вещества, имеющие большую поверхность частиц (гель фосфата кальция и гель гидроокиси алюминия), характеризуются высокой адсорбционной способностью. Разные белки адсорбируются и элюиру-ются по-разному, что и дает возможность использовать адсорбенты для очистки ферментов. Различают негативную адсорбцию, когда при добавлении адсорбента фермент остается в растворе, и положительную адсорбцию, когда фермент адсорбируется, а часть балластных белков остается в растворе. Наибольший эффект достигается при их совместном использовании, т. е. сначала адсорбируют возможное количество балластных белков, следующей порцией геля адсорбируют фермент, а затем его элюируют. Адсорбция лучше идет при достаточно низкой концентрации солей в растворе и рН 5—6.

Адсорбционные свойства свежеприготовленных алюминиевого и кальций-фосфатного гелей изменяются при хранении. Поэтому в литературе встречаются рекомендации использовать для работы «постаревшие» (в течение нескольких недель или месяцев) гели. Однако каждый раз требуемое количество геля, необходимое для адсорбции фермента или балластных белков, приходится подбирать экспериментально. Обычно оно не соответствует количествам, использованным в предыдущем выделении или указанным в методике.

Необходимое количество геля подбирают следующим образом. В несколько пробирок наливают одинаковое количество ферментного раствора (минимальный объем) и добавляют разные количества геля. Перемешивают до получения однородной суспензии, центрифугируют и в центрифуге определяют ферментативную активность. То соотношение геля к ферментному раствору, при котором в надосадочной жидкости остается примерно 90% первоначальной активности п

страница 103
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
компьютерные столы mik
ложка для грейпфрута купить в москве
Пуфики Дорогие
хранить вещи москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.03.2017)