химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

МЕТОДЫ ОЧИСТКИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Перед тем как приступить к выделению и очистке того или иного •фермента, необходимо выбрать удовлетворительный тест для его идентификации и количественного определения. Прямые методы существуют лишь для очень ограниченного круга ферментов, поэтому используют способность ферментов катализировать специфическую реакцию. Чтобы иметь возможность контролировать степень очистки фермента, его активность относят на 1 мг общего белка (так называемая «удельная активность»).

Так как в процессе выделения фермента необходимо знать лишь относительную активность на отдельных стадиях очистки, то выражать ее можно в условных единицах (например, в единицах оптической плотности). Их выбор определяется методом измерения активности. После получения гомогенного или высокоочищенного препарата фермента его активность и удельная активность должны быть определены с использованием наиболее точных методов их измерения и выражены в международных единицах. Результаты очистки фермента суммируют в таблице:

Стадия очистки Объем ферментного раствора Активность в 1 мл Общая активность Белок, мг Удельная активность 'Степень очистки Выход фер мента, % от исходной актив, гости

1

Экстракция

Работу по выделению фермента начинают с разрушения клеточной оболочки тканей, в результате чего фермент переходит в экстрагирующий раствор. Мышечную ткань можно разрушить с помощью мясорубки, а также гомогенизатора. Клеточную оболочку в ткани печени удобно разрушать обработкой ацетоном. Для этого ее помещают в гомогенизатор, заливают несколькими объемами ацетона, предварительно охлажденного до —20° С, и гомогенизируют на холоде 1—2 мин. Полученный гомогенат быстро фильтруют на воронке с отсасыванием. Осадок еще раз аналогично обрабатывают ацетоном, затем измельчают вручную (в ступке) при комнатной температуре и помещают в вакуум-эксикатор. Ацетоновый порошок может храниться в холодильнике несколько месяцев и использоваться по мере надобности. Обработка ацетоном не только разрушает клеточную оболочку, но также обезвоживает ткань и освобождает ее в значительной степени от липидов. Одним из наиболее часто применяемых способов разрушения клеточной оболочки дрожжей является автолиз. Дрожжи предварительно можно высушить, что позволяет хранить их, как и ацетоновые порошки животных тканей, длительное время в холодильнике (в герметической упаковке). От условий высушивания дрожжей часто зависят выход фермента и его удельная активность.

Для экстракции обычно используют тот или иной буферный раствор. При работе с интенсивно гликолизирующими тканями (например, мышечной) буфер можно заменить слабым раствором щелочи.

Если фермент характеризуется повышенной восприимчивостью к ионам тяжелых металлов и нет уверенности в полном их отсутствии

в используемых реактивах, рекомендуется экстракцию и всю последующую очистку фермента проводить с добавлением ЭДТА.

Клеточный экстракт наряду с интересующим ферментом содержит и другие вещества белковой и небелковой природы. От них избавляются с помощью различных методов фракционирования. Последовательность их применения может быть различной, но целесообразно, в частности, учитывать специфику фермента. Например, если фермент термостабилен, следует, очевидно, начать с термической обработки, что даст возможность сразу же избавиться от большинства термолабильных белков. Обычно белки неустойчивы в кислых растворах, поэтому если фермент выдерживает подкисление, его очистку следует начинать именно с этой стадии и т. д.

Осаждение белков при изменении рН

При выделении фермента используют метод фракционирования белков путем изменения рН. Очистка фермента на этой стадии достигается за счет денатурации белков, которые отделяют центрифугированием. Изменение рН белкового раствора следует осуществлять осторожно, по возможности не использовать сильные кислоты и щелочи. Рекомендуется добавлять уксусную кислоту, трис-буфер, карбонат натрия и др. Добавление соответствующего буфера или кислоты проводят на холоде. Их вносят по каплям, по стенке сосуда, при постоянном перемешивании. После нейтрализации раствора проводят короткую инкубацию при 25—30° С, чтобы перед центрифугированием произошла полная агрегация денатурированных белков.

Термическая обработка

Температура денатурации разных белков неодинакова. Используя даже сравнительно мягкие условия нагревания, можно добиться коагуляции значительной части балластных белков без существенной инактивации выделяемого фермента.

Тепловую обработку лучше проводить в круглодонной колбе (можно и в химическом стакане), помещая ее в водяной термостат. Чтобы ускорить процесс нагревания ферментного раствора, его погружают в водяную баню с температурой, на 20—30° С выше той, при которой пройдет тепловая стадия. Энергичное перемешивание, необходимое для равномерного нагревания, осуществляется быстрым вращением сосуда с раствором или с помощью механической мешалки.

По окончании термической обработки ферментный раствор быстро охла

страница 101
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
промышленные стулья винтовые
садовые качели распродажа скидки и акции в оби
матрас на диван тонкий
тод рок опера

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.03.2017)