химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

определения каталитической активности и кинетических свойств. Во второй части раздела описываются методы выделения ферментов из пекарских дрожжей и животных тканей (скелетных мышц, печени). Поскольку современные методы очистки ферментов включают большое разнообразие приемов, в ряде случаев для получения одного и того же фермента дается описание 2—3 методик, которые могут быть использованы в соответствии с уровнем оснащенности лаборатории. Кроме того, для ферментов из разных источников приводятся различные методы выделения.

Учитывая важное практическое значение иммобилизации ферментов, а также возможность использования иммобилизованных препаратов ферментов в фундаментальных исследованиях, в раздел включен ряд задач по иммобилизации препаратов ферментов, выделенных студентами самостоятельно.

Практическая работа в лаборатории сопровождается проведением семинаров, где рассматриваются теоретические вопросы, связанные со способами очистки ферментов, оптимизацией методов определения активности, а также вопросы ферментативной кинетики растворимых и иммобилизованных ферментов. Обсуждаются и основные экспериментальные результаты, полученные студентами.

I. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ РАБОТЫ С ФЕРМЕНТАМИ

Большинство ферментов являются лабильными белками. При переводе их в экстракт они лишаются своего естественного (в клетке) окружения и легко подвергаются денатурации и инактивации под влиянием различных факторов. В связи с этим при выделении и очистке ферментов необходимо соблюдать целый ряд предосторожностей. Как правило, все операции следует проводить при 2—4° С (лучше — в холодной комнате), а фракционирование органическими растворителями — при температуре ниже 0° С.

В исходном экстракте ферменты относительно стабильны, что объясняется наличием большого количества других белков. В процессе очистки стабильность выделяемого фермента снижается, поэтому вся работа должна проводиться по возможности быстро, особенно на тех стадиях, на которых фермент подвергается жестким воздействиям, таким, например, как фракционирование органическими растворителями.

С помощью соответствующего буфера необходимо поддерживать значение рН в достаточно узком диапазоне, так как ферменты весьма чувствительны к его изменению. Контроль рН осуществляют с помощью рН-метра. Добавление кислоты или щелочи в процессе работы делают осторожно, по стенке сосуда, с помощью капилляра или пипетки при интенсивном перемешивании.

Химические реактивы должны быть высокой степени чистоты. В противном случае их перегоняют (жидкие) или перекристаллизовы-вают. Особое внимание следует обратить на качество сульфата аммония, который часто используется при выделении многих ферментов. Когда фермент характеризуется повышенной чувствительностью к ионам тяжелых металлов, рекомендуется перекристаллизацию сульфата аммония проводить в присутствии ЭДТА (если это вещество не влияет на активность фермента) в концентрации —0,5—2,0 г/л.

Для работы с ферментами в большинстве случаев используют бидистиллированную воду.

При выделении фермента на разных стадиях его очистки требуется интенсивное перемешивание раствора. Чтобы предотвратить сильное вспенивание и возможность денатурации фермента на поверхности раздела, используют различные типы мешалок. Целесообразно использовать мешалки с большими лопастями, что дает возможность, не снижая эффективности перемешивания, снизить скорость их вращения. Лопасти мешалки должны быть как можно глубже погружены в перемешиваемый раствор. При работе с небольшими объемами удобно использовать магнитные мешалки.

При добавлении к ферментному раствору соли может происходить интенсивное выделение пузырьков воздуха. Поэтому необходимо предварительно ее измельчить и добавлять небольшими порциями. Переливать раствор из сосуда в сосуд нужно медленно, по стенке сосуда, с помощью стеклянной палочки.

Образующиеся в процессе фракционирования осадки в большинстве случаев отделяют от маточного раствора на рефрижераторной центрифуге. Значения g, указываемые в предлагаемых методиках выделения ферментов, можно, как правило, снижать, соответственно увеличивая время центрифугирования (при фракционировании органическими растворителями этого делать не следует). Всегда нужно стремиться получать осадки максимальной плотности: это увеличивает эффективность фракционирования, если выделяемый фермент находится в осадке, и повышает его общий выход, если он находится в маточном растворе. Получение плотного осадка после осаждения фермента органическими растворителями позволяет быстро понизить их концентрацию последующим добавлением небольшого объема воды или буферного раствора.

При работе с большими объемами и осадками, которые плохо отделяются центрифугированием, можно использовать фильтрование на химических воронках большого диаметра через складчатый фильтр.

В некоторых случаях более эффективным оказывается фильтрование под вакуумом. Однако важно, чтобы при этом не происходило вспенивание раствора, так как оно может привести к денатурации фермента.

1. ЭКСТРАКЦИЯ,

страница 100
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ручка renz сиракузы ob/oc
Royal London Gents Watch 41106-03
ремонт вмятин от града без покраски
контейнер металлический с крышкой

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)