химический каталог




Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии

Автор О.Б.Рудаков, И.А.Востров, С.В.Федоров, А.А.Филиппов и др.

(Н2),0—ПуЦОНКН,—N

-стнк

а—OCHjCO—HN(CH2)4NH—СОСНг—N

Как показано выше, активные центры сорбента, удерживающие сорбат, обычно представляют собой систему ион переходного металла - иминодиа-цетатная группа, связанная с матрицей через длинные кислород- или азотсодержащие мостики.

с)

Рис. 1.19. Механизм разделения веществ в афинной хроматографии: а) иммобилизация лиганда на матрице; Ь) нековален-тное связывание целевого вещества и удаление сопутствующих примесей; с) десорбция целевого компонента

74

Матрица сорбента должна быть доступной для макромолекул белка, чтобы обеспечить возможность образования разнолипщд-ных сорбционных комплексов. Этому условию удовлетворяют гели с высокой набухаемостыо (сефадекс

6В, СМ-сефадекс С-50, трисакрил GF 2000 и другие так называемые аффи-гели) и слабосшитые ионообменники, В качестве подвижной фазы используют буферы в интервале значений рН от 6 (ацетатный буфф) до 8 (фосфатный буфер). Можно создать такие условия (значения рН и концентрация солей), при которых взаимодействие целевого сорбата с лигандом будет наиболее сильным. Десорбцию и элю-ированиесвязанного белка осуществляют тремя способами. Так, при понижении рН подвижной фазы происходит протонирование домор-ных групп белка и диссоциация его сорбционного комплекса.

Следует помнить, что иминодиацетатные группы неподвижной фазы также способны протонироваться и терять связанный с ними ион металла, в связи с этим рН меньше 5 нежелательны. Молекулы белка можно вытеснить из сорбента лигандным обменом, используя имидазол. Последний образует более устойчивый комплекс. Наконец, сорбционные комплексы можно разрушить при низких рН средним по силе хелатообразующим агентом (гистидином) или сильным хелатирующим агентом (зтилендиаштнтетрауксусной кислотой), что приводит к освобождению белка и десорбции металла. Этот способ эффективен для выделения ферментов, принадлежашлх к классу металлопротеинов. Молекулы белка, не имеющие на своей поверхности остатков гистидина или триптофана, не удерживаются гелем ГОА-Си2*, а присутствие хотя бы одного остатка гистидина в молекуле белка достаточно для его удерживания гелем ГОА-Си2* при нейтральном значении рН. Для удерживания белков, содержащих триптофан, требуется несколько остатков этой аминокислоты в молекуле белка. Если сорбат слишком прочно связан с лигандом, всостав буффа вводят анионы СЮ*, CFjCOO, SCN, (CI СО, разрушающие водородные связи.

В афинной хроматографии выделяют специальный способ, названный афинной хроматографией на лабильных лигандах. Этот вариант разработан для того, чтобы преодолеть необратимую сорбцию ряда специфических белков к кобаламину, который используется в качестве привитого к матрице хелата. Вместо ковалентной иммобилизации этого хелата гидроксикобаламин или цианокоба-ламин предварительно координируют с матрицей сефарозы, содф-жащей первичные аминогруппы. Белки, специфически связываю75

щисся с кобаламином, селективно сорбируются на холоде (4 °С) на полученной неподвижной фазе. Затем их выделяют снова в форме комплексов с кобаламином путем повышения температуры колонки до 37°С, при которой происходит разрушение координационных связей с кобаламином. В методе афинной хроматографии на лабильных лигандах в ходе сорбции образуется одна координационная связь, а в процессе десорбции диссоциирует другая координационная связь, так что центральный ион металла вместе с дополнительным (лабильным) лигандом изменяет свою локализацию, переходя из неподвижной фазы к лабильному лиганду [152].

К настоящему времени разработан широкий ряд хелатообразу-ющих сорбентов, позволяющих разделять на основе биоспецифических взаимодействий [152-174].

1.4.9. Эксктозиомтя хроматография

Зксклюзиоиная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами, т.е. неподвижной фазой служит пористое тело или гель, а различное удерживание веществ обусловлено различиями в размерах молекул веществ, их форме и способности проникать в поры неподвижной фазы. В названии метода отражен механизм процесса, от английского термина "SkeEwiusion", означающего "исключеткмю размеру". Гелъ-прокикаюиря хроматография (ГПХ) - зксклюзиоиная хроматография, в которой неподвижной фазой служит гель.

В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с повфхностью сорбента, роль твердого ншюлнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс - от 10г до 1С, что делает его незаменимым для исследования синтетических высокомолекулярных веществ и биополимеров [12,14,57,175-191].

76

Рассмотрим.принщ1пиальные основы метода. О

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171

Скачать книгу "Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии" (8.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
новая рига 100 км
купить моноколесо в санкт-петербурге
расходные материалы для наружной рекламы toshiba
диагностика чиллера

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.05.2017)