химический каталог




Химия биологически активных природных соединений

Автор Н.А.Преображенский, Р.П.Евстигнеева

ких, как РО7, +NH3 и СОО~ в фосфатидилсерине обусловливает его способность к образованию хелатных ионов с Са2+ и Mg2+.

Наличие электростатически заряженных групп в полярных частях молекул фосфолипидов обеспечивает их взаимодействие с противоположно заряженными ионами, находящимися в водной среде; результатом этого взаимодействия является возникновение определенного электрического потенциала, что важно для мембранных процессов.

Считают, что все фосфолипиды нерастворимы в ацетоне, лецитины^, растворимы в спирте, а фосфатидилэтаноламины и фосфатидилсерины в спирте нерастворимы. Однако это обобщение не совсем правильно, поскольку растворимость полярного липида в органических растворителях зависит от длины цепи и степени ненасыщенности (т. е. от соотношения гидрофобных и гидрофильных областей). Фосфатидилхолины, углеводородные цепи которых содержат менее 10 атомов углерода, хорошо растворимы в ацетоне, соединения с более длинной углеводородной цепью нерастворимы. Аналогично, растворимость фосфатидилхоли-нов в спирте уменьшается с увеличением длины цепи гидрофобных остатков. Кроме того, на растворимость липидов может оказывать влияние присутствие других типов липидов.

В полярных растворителях, таких, как спирт, фосфолипиды моно-мерны, в неполярных растворителях, например в бензоле, они образу-' ют мицеллярные агрегаты с различной молекулярной массой (50 000 и более). В этом случае полярные группы направлены внутрь частицы* а гидрофобные цепи наружу.

268

Химические свойства фосфолипидов

Фосфолипиды проявляют химические свойства, типичные для диэфи-ров фосфорной кислоты, особенно в условиях гидролитического расщепления [115]. При рН 7 фосфолипиды устойчивы, лишь в незначительной степени происходит гидролиз сложноэфирных связей, однако в кислой и щелочной средах они достаточно быстро гидролизуются.

При щелочном гидролизе фосфолипидов первоначально образуются жирные кислоты и замещенные глицерофосфаты. Однако в последних фосфоэфирная связь с гидрофильной компонентой X не устойчива к гидролизу и расщепляется с образованием пятичленного циклического фосфата, при раскрытии цикла которого получается смесь 2- и 3-глицеро-фосфатов в отношении примерно 1:1. Атака НО- по асимметрическому центру при С2, приводящая к глицеро-3-фосфату, может сопровождаться инверсией конфигурации:

CH2OCOR СН2ОН I но- I RCOO—С—Н О -—-»- НО—С—Н О

2RCOOH | || —XOH

СНаО-Р—ОХ СН20—Р—ОХ

А- А-

' СН2ОН СН2ОН СН2ОН О I I I II ->- О^ /О—С—Н ->- НО—С—Н О + СН— О— Р—сг

I I II I I

"О/ \0—СН2 СН20—Р—О" СН2ОН О"

I

О-

В кислой среде равновесие между 2- и 3-фосфатами смещено в сторону 3-фосфата.

Обработка фосфолипидов уксусным ангидридом приводит к расщеплению фосфоэфирной связи со стороны гидрофобной компоненты и последующему ацетилированию образовавшегося диглицерида; при этом возможна ацильная миграция.

При действии диазометана расщепляется связь между фосфатидо-вой кислотой и полярной компонентой X и образуется диметиловый эфир фосфатидовой кислоты, сохраняющий первоначальную конфигу» рацию:

CH2OCOR CH2OCOR

I CH2N2 I

R'COO—C—H О ->- R'COO—C—H О

I II - I II

СНаО-Р—OX СН20-Р(ОСНз)2

I

OH

При действии литийалюминийгидрида на диацильные фосфолипиды расщепляются обе фосфоэфирные связи и сложноэфирные группы:

CH2OCOR СН2ОН ! [Н] I

R'COO-C-H О ———-— -*- СНОН +RCH2OH + R'CH2OH .

I II —XUH; — H3FU4 |

сн2о—Р—ОХ СН2ОН

I

. О"

269

В случае фосфолипидов с простой эфирной связью происходит частичное расщепление молекулы с сохранением простой эфирной связи [116]:

CH2OR I

С—Н + R'CH2OH I

СН2ОН

R = (СН2)„СН3; CH=CHR"

МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ ФОСФОЛИПИДОВ

Для изучения структуры фосфолипидов используют комплекс химических, ферментативных и физико-химических исследований.

Химические методы. Для анализа фосфолипидов часто используют методы частичного или полного гидролиза или алкоголиза [117]. Так, с целью определения жирнокислотного состава фосфолипидов проводят их метанолиз и полученные метиловые эфиры жирных кислот анализируют с помощью газо-жидкостной хроматографии. Щелочной гидролиз спиртовым раствором едкого натра дает водорастворимые фосфо-эфиры, которые могут быть разделены и идентифицированы с помощью бумажной хроматографии.

В процессе щелочного и кислотного гидролиза фосфолипидов возможны вторичные изменения (например, миграция фосфатного остатка, рацемизация), в связи с чем следует проявлять определенную осторожность при интерпретации полученных данных [118].

Для определения положения жирных кислот в фосфолипидах используют метод ацетолиза. Ацетаты, получаемые при действии уксусного ангидрида на фосфолипиды, исследуют методами газо-жидкостной или тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем, им-прегнированным AgN03, где достигается их разделение по длине цепи, степени ненасыщенности, а также разделение изомеров с различным положением ацильных групп.

С помощью химических методов проводят определение присутствующих в фосфолипиде функциональных групп; например, используют ацилирование (ОН- и iNH2-rpynnbi), периодатное окисление (вицинальная гликольная группировка), реакцию с 2,4-динитрофторбензолом (NH2-rpynna) и т. д. Титрование кислотами и основаниями в неводной среде позволяет определить тип фосфолипида и его чистоту.

Способность к соле- и комплексообразованию часто позволяет различать типы фосфолипидов. Например, фосфатидилхолины легко образуют комплексы с CdCl2, а кислые фосфолипиды дают свинцовые соли.

Для качественного и количественного анализа фосфолипидов в настоящее время широко используют тонкослойную хроматографию на силикагеле [3]. При этом применение специфических реагентов, дающих характерное окрашивание для отдельных классов фосфолипидов, помогает осуществить их идентификацию. С помощью ТСХ может быть достигнут количественный анализ фосфолипидов при проведении ден-ситометрических измерений пятен после проявления хроматограммы или путем анализа элюированных веществ на содержание фосфора.

CH2OR

R-COO-i-H V -хсяГ-НзРоГ Н°-СН20—Р—ОХ

I

О"

276

Ферментативные методы. Для изучения структуры фосфолипидов широкое распространение получили ферментативные методы, с помощью которых осуществляется специфическое расщепление сложно-эфирных связей фосфолипидов [119, 120].

Известно несколько фосфолипаз, вызывающих специфическое расщепление сложноэфирных групп в фосфолипидах:

фосфолипаза Aj"

фосфолипаэа А2

О

О

сн„—о-с—Р

со_С_Н О ФосФолипаза-^

сн9—О-Р-ОХ

v |_ о

фосфолипаэа С'

В большей степени изучено строение фосфолипазы А2 (фосфатид-ацилгидролазы, ЕС 3.1.1.4), обнаруженной в различных тканях животного организма (поджелудочная железа, печень, почки, мозг и т. д.) [121], змеином и пчелином яде, а также в некоторых бактериях (например, Е. Coli) [122]. ¦

Фосфолипаэа Аг поджелудочной железы свиньи [123] представляет собой белок с молекулярной массой 14 000, присутствует в виде ферментативно неактивного зимогена, активация которого достигается расщеплением связи Arg—Ala, что приводит к образованию фосфолипазы Аг и гептапептида. Фосфолипаэа А2 содержит 123 аминокислоты и 6 дисульфидных мостиков. Определена полная аминокислотная последовательность фермента и расположение дисульфидных связей.

Фосфолйпаза А2 гидролизует сложноэфирную связь в положении 2 во всех природных фосфоглицеридах, включая лецитины, кефалины, серинфосфатиды, фосфатидовые кислоты, фосфатидилглицерин и его аминокислотные производные, фосфатидилмиоинозит, а также плазмалогены, т. е. присутствие различных гидрофильных и гидрофобных компонент не влияет на ее специфичность, но существенно влияет на скорость гидролиза. Природа жирнокислотных остатков также не оказывает влияния на специфичность действия фосфолипазы А2, а сказывается лишь на скорости расщепления. Фосфолипаэа А2 проявляет высокую стереоспецифичность, расщепляя только производные З-вп-гли-церофосфата, что используется в структурном анализе природных и синтетических фосфолипидов. Фермент проявляет активность в присутствии ионов Са2-1", рН оптимум 7,2.

В микросомальных фракциях различных тканей млекопитающих (мозг, поджелудочная железа, печень, селезенка и др.) обнаружена фосфолипаэа А4 (фосфатид-ацилгидролаза, ЕС 3.1.1.4), вызывающая расщепление сложноэфирных связей в положении 1 различных классов, фосфоглицеридов. Известно, что фермент проявляет стереоспецифичность, аналогичную фосфолипазе А2, термически лабилен и имеет рН оптимум при 4,2.

Панкреатическая липаза (гидролаза эфиров глицерина, ЕС 3.1.1.3) гидролизует сложноэфирные связи в положении 1 фосфоглицеридов, однако не проявляет стереоспецифичности, свойственной фосфолипазам Ai и А2. Известна также лизофосфолипаза (лизол ецитин-ацилгидрола-

271

за, фосфолипаза В, ЕС 3.1.1.5), получаемая из животных источников и катализирующая гидролиз сложноэфирной связи в 2-лизофосфолипи-дах (т. е. липидах, содержащих ОН-группу при Сг).

Наряду с фосфолипазами, действующими на сложноэфирные связи с остатками жирных кислот, выделены липолитические ферменты, специфично расщепляющие фосфоэфирные связи. Из ряда бактериальных культур (например, Clostridium welchii. Bacillus cereus и др.) выделена фосфолипаза С (фосфатидилхолин-холинфосфогидролаза, ЕС 3.1.4.3), которая расщепляет фосфоэфирную связь с образованием 1,2-диацил-sn-глицерина и монофосфата гидрофильной компоненты X [14]. Фосфо-липазы С из разных источников проявляют различную активность по отношению к различным классам фосфолипидов. Например, фосфолипаза С из Clostridium welchii гидролизует только фосфатидилхолины, а фермент из Bacillus cereus расщепляет большинство классов фосфолипидов.

В значительных количествах в хлоропластах ряда растений (морковь, капуста, шпинат, сахарная свекла) обнаружена фосфолипаза D, которая расщепляет фосфоэфирную связь между фосфатидовой кислотой и гидрофильной компонентой (X), что приводит к образованию фосфатидовой кислоты.

Замена жирнокислотного остатка на 1-алкенильноэфирную группу в плазмалогенах не изменяет специфичности липолитических ферментов, но существенно отражается на скорости гидролиза. Так, плазмалогены, как правило, расщепляются с меньшей скоростью, чем фосфолипиды ацильного типа [124]. Кроме указанных ферментов, выделены ферментные системы, расщепляющие алкенильноэфирную группу в плазмалогенах.

Используя совокупность указанных ферментативных превращений, можно провести структурный анализ фосфолипидов. Так, с помощью фосфолипаз Ai и Аг в сочетании с различными хроматографическими методами можно определить состав и положение жирных кислот в фосфолипидах. Именно ферментативные методы позволили выявить определенные закономерности в расположении жирных кислот в фосфолипидах: ненасыщенные жирнокислотные остатки обычно этерифицируют гидроксил при С2.

Широкое применение фосфолипазы нашли в стереоспецифическом анализе фосфолипидов.

Фосфолипаза Аг используется в синтетических целях [125] при получении определенных молекулярных видов фосфолипидов, а также при синтезе образцов с радиоактивной меткой, которые необходимы при проведении различных биохимических исследований.

Для изучения молекулярных видов фосфолипидов (т. е. фосфолипидов одного типа, отличающихся природой жирных кислот), используют их расщепление фосфолипазой С. Образующиеся при этом, 1,2-ди-ацил-зп-глицерины (или их производные) далее разделяют по.степени ненасыщенности в слое. силикагеля, импрегнированного нитратом серебра. Диглицериды затем обрабатывают панкреатической липазой для определения положения жирных кислот.

В настоящее время ферментативные методы являются наиболее перспективными и надежными в структурном анализе фосфолипидов.

Физико-химические методы. В химии фосфолипидов широко- используется ИК-спектроскопия. Она дает информацию о классе фосфолипи-

272

дов, позволяет осуществить дифференциацию азотистых оснований, сделать выводы о ионной структуре фосфолипидов, определить наличие ряда функциональных групп (например, ОН, NH2, СООН, ОСН=СН— и т. д.) в гидрофобной и гидрофильной частях молекулы [14].

Спектры ЯМР до недавнего времени применялись лишь для исследования отдельных фрагментов фосфолипидов, однако в настоящее время их используют для исследования нативных фосфолипидов и даже их комплексов, например с белками.

Для установления оптической чистоты фосфолипидов определяют их удельное вращение или используют метод дисперсии оптического вращения (ДОВ). В случае фосфолипидов, как правило, в области длин волн 230—600 нм получаются плавные кривые и метод ДОВ используется для определения оптической чистоты путем сопоставления оптических характеристик данного фосфолипида или соединения, полученного на его основе, с оптическими характеристиками известного соединения (химическая корреляция).

Общие методы исследования структуры фосфолипидов в зависимости от решаемых вопросов приведенных ниже.

I. Определение типа фосфолипидов.

1. ТСХ и идентификация со свидетелями.

2. ИК-спектроскопия.

3. Титрование кислотами и щелочами в неводной среде.

4. Действие специфических реагентов на фуикциональиые_ группы: 2,4-дииитрофтор-бензол (NH2); ацилирование (ОН, NH2); окисление Ю4 (вицииальиая гликольиая группа).

5. Химический гидролиз и идентификация водорастворимых фрагментов.

6. Ферментативный гидролиз и идентификация фрагментов.

II. Определение общего жирнокислотного состава фосфолипидов.

Метаиолиз (или гидролиз и этерификация высших жирных кислот), затем газо-жид-костная хроматография метиловых эфиров жирных кислот.

III. Определение жирнокислотного состава отдельных классов фосфолипидов.

ТСХ фосфолипидов, гидролиз каждого класса, ГЖХ метиловых эфиров жирных кислот.

IV. Определение распределения жирных кислот между положениями 1 и 2.

1. Гидролиз фосфолипазами, затем ГЖХ метиловых эфиров жирных кислот.

2. Ацетолиз в 1,2-диацил-3-ацетил-5п-глицерины и исследование их с помощью ТСХ (силикагель/АдКОз).

V. Стереоспецифичеокий анализ.

1. Расщепление с помощью стереоспецифичных фосфолипаз.

2. Определение удельного вращения и применение метода ДОВ в сочетании с химической корреляцией.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ СИНТЕЗА ФОСФОЛИПИДОВ

Структура фосфолипидов как несимметричных диэфиров фосфорной кислоты и определяет принципиальные подходы к осуществлению их синтеза.

Основные прблемы синтеза фосфолипидов могут быть сформулированы следующим образом:

1) выбор метода фосфорилирования; >

2) определение последовательности фосфорилирования неполярной (R) и полярной (Р/) групп;

3) выбор фосфорилирующего агента;

4) защита функциональных групп в защищенном фосфате и полярной компоненте молекулы.

18—2394

273

Методы фосфорилирования

При синтезе фосфолипидов применяют общие методы фосфорилирования, используемые в синтезе других классов биологически активных фосфорных эфиров (нуклеотиды, нуклеотидные коферменты и т. д.) [64].

Эти методы можно классифицировать на две основные группы: 1) метод активированных фосфатов и 2) метод серебряных солей.

Метод активированных фосфатов. Для образования

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Химия биологически активных природных соединений" (6.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
онлайн обучение професии холодильщик
colombo дверные ручки
где купить пружинный матрас 140x190 см по низкой ценами
зарядное устройство для гидроскутер купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.11.2017)