химический каталог




Химия биологически активных природных соединений

Автор Н.А.Преображенский, Р.П.Евстигнеева

нцевых аминогрупп и др. Полное доказательство гомогенности исследуемых веществ может дать только сочетание нескольких различных методов!

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРА И ФОРМЫ МОЛЕКУЛ УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Молекулы углевод-белковых полимеров разнообразны по форме и молекулярной массе. Они могут быть сильно вытянуты или иметь форму глобулы. Гликопротеины, содержащие небольшое количество углеводов и близкие по свойствам к белкам, не представляют трудностей для физико-химических определений. Богатые углеводами гликопротеины и полисахарид-белковые комплексы с высокой молекулярной массой и большим количеством заряженных групп, напротив, являются трудными объектами для изучения.

Основные отличия гликопротеинов от белков заключаются в поли-дисперсяости, высокой степени пространственной асимметрии и высокой плотности заряда. Вследствие этого в растворах конфигурация молекул рассматриваемых биополимеров зависит от типа растворителя, концентрации вещества, рН и ионной силы раствора, что безусловно затрудняет применение классических методов белковой химии к изучению таких веществ.

Молекулярная масса углевод-белковых полимеров является величиной усредненной, учитывающей полидисперсность полимеров. Уже на стадии выделения, очистки и определения гомогенности этих биополимеров можно приблизительно оценить их свойства и молекулярную массу. Предварительное определение вязкости веществ и содержания в них сиаловых кислот позволяет выбрать те или иные пути дальнейшего исследования. Молекулярная масса углевод-белковых полимеров может быть рассчитана на основании гидродинамических данных, коэффициентов седиментации, диффузии, характеристической вязкости. Молекулярная масса и форма молекул могут быть вычислены по данным све-

75

торассеяния или осмометрии. Гель-фильтрация на сефадексах позволяет примерно оценить молекулярную массу полимеров и довольно широко применяется в последнее время.

Существенную информацию о форме молекул полимеров, содержащих углеводы и белки, дает электронная микроскопия и дисперсия оптического вращения.

Для получения достаточно достоверных значений молекулярной массы и размеров молекулы следует использовать несколько методов определения.

УСТАНОВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ УГЛЕВОДНЫХ СОСТАВЛЯЮЩИХ УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ

Как указывалось выше, имеются различные типы углевод-белковых соединений, отличающихся по составу и строению углеводных фрагментов и их размерами по отношению к пептидным компонентам. Эти различия определяют способы выделения и очистки таких биополимеров, а также выбор методов, дающих возможность определить структуру соединений или их отдельных участков. Для структурных исследований необходимо использовать препараты веществ, полностью очищенные от примесей.

Углеводные составляющие углевод-белковых полимеров представлены олиго- или полисахаридами. Для установления их структуры применяют различные методы деградации: кислотный и ферментативный гидролиз, периодатное окисление, метилирование и гидролиз, расщепление щелочами. Однако исследуемые биополимеры не всегда могут быть сразу подвергнуты деградации из-за нерастворимости, недоступности атакуемых участков вследствие пространственных затруднений и наличия заряженных групп, затрудняющих атаку расщепляющих реагентов. Существенные трудности для гидролиза представляют остатки аминосахаров и уроновых кислот, гликозидные связи которых устойчивы, поэтому предварительно часто осуществляют превращение этих остатков в производные, не затрудняющие гидролиз.

Сиаловые кислоты, входящие в состав гликопротеинов, защищают их от действия протеолитических ферментов, поэтому необходимо предварительно отщепить их нейраминидазой. После удаления сиаловых кислот глнкопротеины частично расщепляются протеолитическими ферментами (папаин, проназа) на гликопептиды, доступные для дальнейшего исследования. Гликопептиды затем обрабатывают ферментами, отщепляющими аминокислоты (например, карбоксипептидазой после ' защиты конечной аминогруппы), и превращают в олигосахарнды, содержащие только одну аминокислоту. Углеводные компоненты гликопротеинов, имеющих щелочелабильную связь углевод—аминокислота, отщепляют щелочной обработкой или ферментами, разрушающими связи такого типа. Полученные таким образом гетеросахариды или гете-росахариды с одной аминокислотой очищают от примесей пептидов и аминокислот переосаждением из водноорганических смесей (вода-спирт, вода—ацетон), экстракцией фенолом, хроматографией, электрофорезом или гель-фильтрацией.

Дальнейший анализ этих кизкомолекулярных соединений заключается в определении их молекулярной массы, состава, порядка соединения отдельных моносахаридов, типа и конфигурации гликозидных связей с помощью методов, разработанных для исследования строения сложных углеводов.

76

Гидролиз гликозидных связей

Кислотный гидролиз. Для идентификации и количественного определения моносахаридов, входящих в состав олиго- и полисахаридов и углевод-белковых полимеров, применяется кислотный гидролиз, в процессе которого расщепляются гликозидные связи.

В ряде случаев кислотный гидролиз является нелегкой задачей, так как гликозидные связи, образуемые различными моносахаридами, отличаются по устойчивости. Очень стабильны связи у аминосахаров, в то же время проведение гидролиза в более жестких условиях усиливает деструкцию моносахаридов.

При гидролизе возможна «кислотная реверсия», т. е. ресинтез олигосахаридов, а также взаимодействие углеводов с аминокислотами (реакция Майяра). Установлено, что в реакцию с .аминокислотами вступают только восстанавливающие сахара, причем пентозы более реакционноспособны, чем гексозы. Среди гексоз наибольшая реакционная способность отмечается у D-фруктозы, затем следуют D-галактоза, D-манноза и D-глюкоза. Ацилированные аминосахара не вступают в реакцию с аминокислотами до температуры 53 °С.

Вероятно, что начальной стадией реакции Майяра является образование N-замещенных гликозиламинов путем взаимодействия непро-тонированной аминогруппы аминокислот, пептидов или белков с гли-козидным гидроксилом моносахарида, затем образуется шиффово основание. Однако нельзя исключить и возможность реакции аль-фор-мы гексозы (R'CHO) с аминокислотой:

—О -H*o RCH—NH? + < )\ ^= ОН

О

СОО

NH—CHR I

СОО"

М-замеш,енный гликозиламин

R'CHO

-*¦ RCH—N=CHR

I

COO

N-Замещенные гликозиламины в условиях кислотно-основного катализа изомеризуются в N-замещенные 1 -амино- 1-дезокси-2-кетозы (перегруппировка Амадори):

NHaR

СН— I

СНОН

I

снон I

сн—

снон I

сн2он

NHR II

СН

I

снон I

снон I

снон

снон I

снаон

NHR

I

сн II

сон I

снон I

снон

I

снон I

СНаОН

NHR

I

сн.

но-с-I

снон |

I л 0

снон

сн-

CHj

,он

77

Согласно предложенному циклическому механизму перегруппировки, протонированный гликоэиламин под действием молекулы воды (или метанола) претерпевает раскрытие пиранозного кольца с образованием альдимина, который превращается затем в аминоенол. Последний образует равновесную смесь с циклической и кетоформами производного фруктозы. Аминоенол 'способен также претерпевать деградацию с отщеплением воды и образованием производных фурана. Для протекания перегруппировки Амадори необходимо, чтобы аминный азот в исходном гликозиламине обладал достаточной основностью, позволяющей его протонирование.

Предполагаемые промежуточные продукты перегруппировки Амадори аналогичны продуктам реакции Лобри де Брюина — Альберда ван Экенштейна (см. стр. 29), однако реакция Лобри де Брюина — Альберда ван Экенштейна обратима и количество продуктов разложения в ней незначительно, а перегруппировка Амадори, напротив, практически необратима и количество получаемых при этом окрашенных продуктов деградации сопоставимо с количеством основного вещества.

В соответствии с изложенным выше становится очевидной необходимость тщательного подбора условий гидролиза, ограничивающих протекание побочных реакций.

Принято считать, что кислотный гидролиз гликозидов протекает по мономолекулярному механизму и инициируется протонированием гли-козидного гидроксила. Общая скорость гидролиза определяется рядом факторов: характером агликона, конформацией молекулы, размерами окисного цикла, конфигурацией гликозидной связи и наличием в молекуле Сахаров групп, несущих заряд (СООН, NH2). Гликозидные связи фураноз расщепляются 'быстрее, чем в случае пираноз. Еще быстрее гидролизуются кетозиды, например фруктофуранозиды расщепляются в 10 000 раз быстрее, чем изомерные альдопиранозиды. Повышенной лабильностью отличаются гликозидные связи 2-дезокеисахар^ов (фуко-за). Существует различие и в скорости гидролиза а- и В-гликозидов, что, очевидно, связано с пространственными факторами. В большинстве случаев а-гликозидные связи гидролизуются быстрее, чем В-связи. Отмечается большая лабильность а-(1—>4)-связей по сравнению с а-(1—>-6) -связями.

Очень устойчивы к кислотному гидролизу гликозидные связи 2-ами-но-2-дезоксисахаров. Возможной причиной устойчивости таких связей к гидролизу является ингибирование протонирования гликозидного гидроксила вследствие влияния положительного заряда группы +NH3 при С2. Этот фактор оказывается существенным и при гидролизе N-замещенных аминосахаров, так как одновременно протекает гидролиз амидной связи.

В некоторых полимерах, содержащих аминосахара, например в гепарине, присутствуют лабильные сульфаминогруппы. Гидролиз гликозидных связей этих соединений протекает значительно медленнее, чем в случае N-ацилированных производных. Определенные трудности встречаются и при гидролизе углеводных последовательностей, содержащих остатки уроновых кислот.

Приведенные данные об устойчивости различных гликозидных связей показывают, что выбор оптимальных условий кислотного гидролиза может способствовать более или менее направленному расщеплению гликозидных связей с разрывом связей одного типа и сохранением

78

других связей и получением наряду с моносахаридами олигосахаридов. Так, для некоторых природных олигосахаридов оказалось возможным подобрать условия для избирательного отщепления оиаловых кислот и фукозы. При гидролизе полисахаридов соединительной ткани происходит их частичное расщепление до дисахаридов: из тиалуроновой кислоты получается гиалобиуроновая кислота, а из хондроитинеульфа-тов —: хондрозин.

Для частичной деструкции полисахаридных цепей хорошие результаты дает ацетолиз — обработка смесью уксусного ангидрида и уксус-, ной кислоты в присутствии серной кислоты. При ацетолизе не отщепляются сиаловые кислоты и возможно получение олигосахаридов, содержащих этот углевод. Для деструкции полисахаридов применяют также метанолиз, меркаптолиз и формолиз.

Перспективным методом является гидролиз полистиролсульфокис-лотами, растворимыми или нерастворимыми в воде. Для кислот этого типа характерна высокая локальная концентрация ионов водорода при общей низкой кислотности раствора, что обусловливает высокую эффективность гидролиза. Гидролиз поли- и олигосахаридов полимерными сульфокислотами можно сочетать с диализом, отделяя образовавшиеся при гидролизе олигосахариды от гидролизующего реагента, что позволяет избежать их дальнейшей деструкции, а также кислотной реверсии.

Интересным подходом является разработка методов модификации гетеросахаридов, стабилизирующих или, наоборот, лабилизующих некоторые гликозидные связи. Например, в полимере остатки уроновых кислот превращают в амиды, а затем в амины по реакции Гофмана, после чего становится возможным расщепление в мягких кислотных условиях [61]. Имеются данные о возможности избирательного щелочного расщепления полисахаридов алкоголятом натрия по гликозид-ной связи с остатками уроновой кислоты. Это расщепление приводит к ненасыщенному соединению:

COOR COOR

OH OH

Ферментативный гидролиз. В структурных исследованиях углевод-белковых полимеров важная роль принадлежит ферментам, специфически отщепляющим определенные сахара или гидролизующим гликозидные связи определенного типа. Характерной особенностью ферментативного гидролиза является гидролиз до низших олигосахаридов, которые в отличие от высших плохо расщепляются ферментами.

Ферменты, расщепляющие гликозидные связи, носят название гликозидаз или глико-гидролаз. Конкретные ферменты называют в зависимости от субстрата. Так, известны различные глюкозидазы, расщепляющие а- (амилазы) или Р- (целлюлазы) глюкозидные связи, галактозидазы, нейраминидазы, гиалуронидазы и т. д. Сравнительно недавно получены ферменты, гидролизующие связи углевод — аминокислота в гликопротеинах.

Щелочное расщепление. Гликозидные связи устойчивы к действию щелочей, но если олиго- или полисахарид содержит восстанавливающий сахар, происходит деструкция углеводной цепи, начиная с этого восстанавливающего остатка. Характер продуктов распада определят

79

ется (положением заместителей, а в случае олиго- и полисахаридов — местом присоединения каждого последующего звена. Деструкция (1—»-3)-гликозидных связей протекает быстро, (1—»4)- и (1—»-6)-гликозидные связи расщепляются значительно медленнее, (1—»-2)-связь устойчива.

При щелочной деградации олигосахаридов, содержащих фукозу, легко отщепляющуюся кислотами, удается сохранить гликозидные связи фукозы. Так, при расщеплении групповых веществ крови А и В получены олигосахарнды, содержащие фукозу [62]:

P-Z)-GalNAcp-(l— 3)-p-Z)-Gal-(l— 4)-D-GalNAcp

2

t 1

L-Fucp

P-D-Galp-(1—3)-P-D-Gal-(l—4)-D-GalNAcp

2

t 1

L-Fucp

Щелочная деградация применяется при исследовании гликопротеинов и гликопептидов, содержащих щелочелабильную связь углевод— аминокислота. Под действием щелочи происходит разрыв этой связи и освобождение олиго- или полисахаридов, в свою очередь подвергающихся щелочной деградации. С целью воспрепятствовать глубокой деградации до сахариновых кислот применяют сочетание щелочной обработки (щелочь или триэтиламин) с восстановлением натрийбор-гидридом. Этот метод эффективен при изучении группоспецифических веществ крови — гликопротеинов, которые содержат разветвленные олигосахаридные цепи, присоединенные к аминокислотной цепи. Значительная часть связей углевод—аминокислота в этих биополимерах щелочелабильна.

Фрагменты, полученные при частичном кислотном или ферментативном гидролизе или сольволизе, а также после щелочной деградации, являются материалом для дальнейших исследований. Качественный и количественный состав олигосахаридов определяется при помощи кислотного гидролиза. Наличие восстанавливающих остатков позволяет судить о разветвленное™ фрагмента. Для полисахаридов с неразвет-вленными цепями восстанавливающая способность дает возможность оценить их молекулярную массу. Обычными реагентами для количественного определения восстанавливающих групп являются гипоиодид натрия, соли меди, феррицианид калия, периодат, цианид натрия.

Метод метилирования

Данный метод заключается в исчерпывающем метилировании олиго-и полисахаридов с последующим гидролизом или метанолизом гликозидных связей и идентификацией метилированных Сахаров. Метод дает возможность определить место присоединения моносахаридов друг к другу, размеры окисных циклов, места разветвлений

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Химия биологически активных природных соединений" (6.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
снять дачу в подмосковье возле озера
снять в аренду кладовку для хранения личных вещей
купить чугунную сковороду гриль в санкт-петербурге
проволока вязальная цена за бухту

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.04.2017)