было получено расстояние между Са2+ и Zn2+, равное 1,37 нм, что согласуется с результатами рентгеноструктурного исследования этого фермента [66]

3. Триплетные состояния

Одним из путей снятия синглетного возбуждения является интеркомбинационная конверсия, в результате которой молекула переходит в триплетное, состояние. Поскольку правила отбора запрещают переходы между возбужденным триплетным и основным синглетным состояниями, время жизни. триплетцого состояния оказывается достаточно большим. Отчасти поэтому, в фотохимических реакциях принимают участие молекулы; находящиеся, преимущественно именно в триплетном возбужденном состоянии,; хНеббычно. высокая реакционная, способность молекул в триплетном состоянии обусловлена также его бирадикаль-ным характером. Несмотря на запрет, безызлучательный переход из триплетного возбужденного состояния в основное синглетное тоже возможен, и поэтому для многих соединений фосфоресценция наблюдается только при низких температурах, когда растворитель переходит в иммобилизованное стеклоподобное состояние.

Г. Фотохимия

Поскольку при переходе в возбужденные состояния (синглетные и триплетные) энергия молекул повышается, последние приобретают химические свойства, которых не было у невозбужденных молекул [67, 67а]. Изменения значений рКа функциональных групп при переходе в возбужденное состояние могут приводить к диссоциации протонов или к их присоединению. Диссоциация на ионы или радикалы иногда сопровождается разрывом связей. Могут протекать реакции фотоприсоединения и фотоотщепления, а также изомеризация молекул, играющая важную роль в функционировании зрительных рецепторов. Возбужденные молекулы могут стать сильными окислительными агентами, способными принимать атомы водорода или электроны от других молекул. Примером такого рода служит фотоокисление ЭДТА рибофлавином (подвергающимся фотовосстановлению, как показано на рис. 8-15). Более важным с точки зрения биологии процессом является фотосинтез, в ходе которого возбужденные молекулы хлорофилла осуществляют фотовосстановление других молекул, временно оказываясь при этом в окисленном состоянии. К сожалению, ценность исследования фотохимических реакций сильно снижается возможностью протекания множества параллельных реакций, зачастую приводящих к образованию огромного количества разных фотохимических продуктов (достаточно взглянуть на тонкослойную хроматограмму продуктов распада рибофлавина, рис. 2-34).

1. Химическое равновесие в возбужденном состоянии

При облучении пиридоксамина, который находится в форме биполярного циклического иона [схема (8-27)] и имеет полосу поглощения 9_ ^тах = 30 700 см^1, максимум флуоресценции- наблюдается при v =25 000 см-1. Если же облучают основный пиридоксамин, находящийся в форме циклического аниона и имеющий полосу поглощения с

Vmax = 32 500 см-1, то максимум флуоресценции наблюдается при 27 000 см-1, т. е. сдвиг от максимума поглощения снова составляет ~5500 см-^. Однако, если то же соединение поместить в кислую среду, в которой Vmax = 34 000 см-1, максимум люминесценции опять наблюдается при 25 000 см~! (т. е. его положение совпадает с таковым для нейтральной биполярной ионной формы) и, следовательно, сдвинут от максимума поглощения на 9000 см"1 [68, 69]. Это явление, наблюдаемое для большинства фенолов, было объяснено быстрой диссоциацией протона фенольной группы, находящейся в фотовозбужденном состоянии. Таким образом, возбужденный пиридоксаминовый катион в кислой сРеде быстро превращается в биполярный ион. Другими словами, фе-нольная группа в возбужденном состоянии становится более кислой, чем в основном.

Прямую информацию о значениях рА"а группы в возбужденном состоянии может дать исследование зависимости интенсивности флуоресценции от рН. Для оценки р/Са фенолов в возбужденном состоянии используется также более косвенная методика (предложенная Фёрсте-ром). Пусть Ei—энергия 0—0-перехода для недиссоциированной формы (определяемая лучше всего как среднее между наблюдаемыми энергиями перехода в спектрах поглощения и флуоресценции), а Е2— энергия 0—0-перехода для диссоциированной формы (анионной в случае фенолов); далее, пусть ЛЯ и ЛЯ* — энтальпия диссоциации соответственно в основном и возбужденном состояниях. Отсюда сразу следует, что

Е1—ЕЪ = АН—&Н*. (13-19>

ДН

Если принять, что изменение энтропии для реакций в основном и возбужденном состояниях одинаково, то мы получим следующие соотношения:

lg {KVK) = Nh(&)f(2,3RT)t (13-20>

или

рК*=рК—(г.ЫО-^ДЧсм-1) при 25°С. (13-21).

Из уравнения (13-21) следует, что сдвиг спектра поглощения основной формы на 1000 см-1 в сторону более низких значений волнового числа, относительно спектра кислой формы соответствует уменьшению рКа для диссоциации кислой формы на 2,1 единицы. Хотя положение 0—0-полосы лучше определять одновременно по спектрам поглощения и флуоресценции, часто снимают лишь спектры поглощения и положение 0—0-полосы определяют по положению максимума полосы поглощения. Так, для пиридоксамина сдвиг максимума поглоще