лжны быть направлены на идентификацию необходимых белков и на изыскание способов осуществления репликации в пробирке при помощи систем, обеспечивающих реализацию этого процесса в живой клетке.

г. Репликация вирусных двухцепочечных RF-молекул

Известно, что для инициации процесса репликации ДНК фага ФХ необходимо наличие в геноме фага специфического гена А. Недавно было показано, что этот ген детерминирует синтез белка с мол. весом 56 ООО — специфической эндонуклеазы надрезающей вирусную цепь RF-формы, что необходимо для начала процесса репликации [209]. По-видимому, после появления такого разрыва стимулируется синтез небольшого участка РНК-затравки. Репликация ДНК протекает в большинстве случаев в двух направлениях (разд. Д, 2), однако репли-кативная форма Ф X образуется, вероятно, только в одном направлении по механизму «разматывающегося рулона» (rolling circle) [210]. В соответствии с этим механизмом [уравнение (15-9)], по мере того как вновь образующаяся цепь вирусной ДНК синтезируется вдоль комплементарной (минус) цепи-матрицы, исходная вирусная ДНК (плюс-цепь) вытеснется в виде одноцепочечного «хвоста».

После этого образуется цепь (возможно, в форме отдельных фрагментов), комплементарная одноцепочечному «хвосту». При полном обороте кольца получается цепь вирусной ДНК в два раза длиннее обычной. Процесс репликации завершается ее расщеплением при помощи соответствующей эндонуклеазы и сшиванием комплементарных нитей в кольцо лигазой.

Е. Рестрикция и модификация ДНК

Между вирусами и бактериями беспрестанно продолжается борьба, причем как атакующий фаг, так и бактерия-хозяин пользуются разнообразными орудиями защиты и нападения. Так, например, после втор

жения в бактериальную клетку многие вирусы не только выключают синтез клеточной ДНК, но и разрушают ее благодаря наличию специфических ферментов (как эндонуклеаз, так и экзонуклеаз), синтез которых закодирован в геноме вируса [211—214]. С другой стороны, бактерии-хозяева используют имеющееся у них оружие и часто с его помощью модифицируют ДНК вируса, защищаясь таким образом от его разрушающего действия1). Так, ферменты, детерминируемые Т-четными фагами, превращают цитидинмонофосфат в З'-окснметил-СТР, причем модифицированные нуклеотиды обнаруживаются в вирусных ДНК [212]. Более того, вновь образованная гидроксильная группа может «быть в различной степени глюкозилирована (гл. 2, разд. Г, 8).

1. Рестриктирующие эндонуклеазы

Бактерии часто переваривают и разрушают ДНК вторгшихся в них вирусов или ДНК, попавшую в клетку при спаривании с бактерией несовместимого штамма. В результате исследований этого интересного явления, получившего название рестрикция, было обнаружено, что ДНК вирусов, способных к репликации лишь в определенных клетках-хозяевах, в специфических местах каким-то образом маркирована. Причем во многих случаях метками являются метильные группы. Оказалось, что соответствующим образом метилированная ДНК не расщепляется бактерией, тогда как неметилированная ДНК расщепляется высокоспецифичной эндонуклеазой именно в тех местах, в которых обычно происходит метилирование. У каждого вида бактерий (а часто даже и у отдельных штаммов в пределах данного вида) имеются свои собственные рестриктирующие ферменты. Рестриктирующие ферменты обладают очень высокой степенью специфичности и часто разрезают ДНК всего лишь в нескольких точках (или рядом с ними), для которых характерна уникальная последовательность оснований. В настоящее время удалось выделить около 45 таких ферментов с разной специфичностью.

1) Любопытно, что бактерии развиваются таким образом, чтобы не мешать росту

фагов. Многие мутанты, однако (grov), блокируют рост фагов Я, ТЗ, Т4, Т7 н т. д., но

сами растут при этом нормально. Тот факт, что такие бактерии не превращаются я

дикий тип, указывает, какое важное значение для бактерии имеет их сосуществование

с фагом. ? ? '? ? ' » ' " :

Рестриктирующие эндонуклеазы, детерминируемые хромосомой Е. coli, — это крупные белки с мол. весом порядка 300 000—400 000, состоящие из полипептидных цепей трех типов. Они явно связываются со специфическими участками и неспецифически разрушают прилегающие к ним участки. Для их действия необходимо наличие АТР, ионов Mg2+ и S-аденозилметионина. Уникальная особенность этих белков состоит в способности вызывать гидролиз необычно больших количеств АТР [215]. Значение всех этих свойств рестриктирующих ферментов остается до сих пор неясным. Второй класс рестриктирующих ферментов состоит из относительно небольших мономерных или димерных белков с мол. весом 50 000—100 000. Местом атаки этих ферментов служат, как правило, нуклеотидные последовательности с локальной симметрией второго порядка [217]. Так, например, для двух рестриктирующих эндонуклеаз, детерминируемых ДНК плазмиды R-фактора Е. coli, и рестриктирующего фермента Hemophilus influenzae были идентифицированы следующие участки расщепления (в приведенной ниже схеме стрелками показаны места расщепления, звездочками — места метили