Кроме того, тот же фермент может катализировать гидролитическое отщепление нуклеотндбв е В'-коица Цепей ДНК. Было показано, что*

описанные активности локализуются в разных частях одной и той же белковой молекулы, как будто ДНК-полимераза I представляет собой продукт двух слившихся генов [197]. В отличие от ДНК-поли-меразы I ДНК-полимеразы II и III не катализируют гидролитическое отщепление нуклеотидов с 5'-конца.

Предполагают, что 3'—5'-экзонуклеазное действие позволяет ДНК-полимеразе I играть роль как бы «корректора». Эта полимераза действует на З'-конце растущей цепи ДНК. Согласно предположению о роли ДНК-полимеразы I как корректора, прежде чем передвинуться в следующее положение^, фермент проверяет правильность образования предыдущей пары оснований. Если предыдущая пара сформирована непраУЧАСТОК БЕЛКА С АКТИВНОСТЬ/О 5'-3 '-ЗКЗА НУКЛЕАЗЫ

Растущар цепь

5' (Матричная цепь )

ГОТОВЯСЬ К ПРИСОЕДИНЕНИЮ СЛЕДУЮЩЕЙ НУКЛЕОТИДНОЙ ЕДИНИЦЫ, ФЕРМЕНТ СДВИГАЕТСЯ В ЭТОМ НАПРАВЛЕНИИ НА О.ЗЧНМ

ЕСЛИ ЭТА ПАРА ОСНОВАНИЙ ОБРАЗУЕТСЯ ЛРАВИЛЬ-НО,ТО ЗКЗОНУКЛЕАЗА НЕ ДЕЙСТВУЕТ В ТАЧКАХ

УКАЗАННЫХ СТРЕЛКАМИ

УЧАСТОК БЕЛКА С АКТИВНОСТЬЮ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ IИ Д~'~5'-ЭКЗОНУКЛ ЕАЭЫ

ВЕЛИ НОВАЯ ПАРА ОСНОВАНИИ ЕСЛИ ПОЛИМЕРАЗА НАХОДИТСЯ

ОБРАЗОВАНА ПРАВИЛЬНО, ТО - НА КОНЦЕ ОДНОЦЕПАЧЕЧНОГО

ПОЛИМЕРАЗА ДЕЙСТВУЕТ В РАЗРЫВА, ТО В ТОЧКЕ УКАЗАНЭТОМ МЕСТЕ НОЙ СТРЕЛКОЙ НАЧИНАЕТСЯ

5'-3'-ЭКЗОНУКЛСАЗНОЕ ДЕЙСТВИЕ

РИС. 15-30. Схематический рисунок, показывающий три типа ферментативной активности ДНК-полимеразы I. Верхний рисунок иллюстрирует 3'-5'-экзонуклеазную или «корректирующую» активность фермента. Хотя на рисунке показано, что фермент передвигается иа одно положение вперед до того, как произойдет следующий этап, на самом деле момент, когда происходит передвижение, не установлен. Нижний рисунок иллюстрирует реакцию полимеризации и 5'-3'-экзонуклеазное действие.

вильно, то фермент работает как экзонуклеаза, удаляя неправильно присоединенный нуклеотид, что позволяет полимеразе присоединить затем нужный нуклеотид. Таким образом, каждая пара оснований проверяется дважды — первый раз до полимеризации и второй раз — после полимеризации. Схематически этот процесс показан на рис. 15-30. На рисунке видно, каким образом может реализоваться 3'—5'-экзонуклеаз-ная активность после того, как фермент достигнет конца промежутка.

» Неизвестно, когда полимераза проверяет правильность спаривания оснований, до или после передвижения к следующему месту полимеризация. Точно установлено лишь то, что фермент удаляет с З^конца любой неправильно спаренный нуклеотид.

Важную информацию удалось получить при изучении процесса репликации при помощи генетических методов [196, 198]. Была получена серия температурочувствительных мутантов Е. coli, не способных к синтезу ДНК- С их помощью в разных точках хромосомной карты удалось идентифицировать гены dnaAy Ву С, D, Е, F и G. Продукты генов А и, возможно, С, необходимы для инициации репликации, но не нужны для элонгации. Гены В, D, Е и G участвуют в элонгации. Гены С и D расположены на карте очень близко друг от друга (89 мин). Сейчас есть основания считать, что они представляют собой один ген. Возможно, что этот ген кодирует синтез бифункционального белка, способного катализировать как процесс инициации, так и процесс элонгации. Продукт гена F был идентифицирован как рибонуклеотидредуктаза [уравнение (14-50)]. Итак, остаются продукты генов В, D, Е и G, играющие, по-видимому, важную роль в элонгации. Ни один из этих генов не детерминирует синтеза ДНК-полимеразы I. Для ДНК-полимеразы III был идентифицирован ген dnaE. Таким образом, ключевая роль этой полимеразы подтверждается генетически. Однако эта полимераза сама по себе не способна реплицировать двухцепочечную ДНК; для ее функционирования необходимо наличие других белков.

Среди ДНК-полимераз эукариотических клеток различают а, р1- и Y-формы, которые обнаруживаются в ядрах (а-форма была обнаружена и в цитоплазме), а также митохондриальный (mi) фермент [199].

Если тот факт, что репликация ДНК У Е. coli начинается процессом специфической инициации, за которым следует элонгация вдоль хромосомы в двух направлениях, установлен вполне надежно, то вопросы, касающиеся терминирования процесса репликации, изучены значительно хуже. В результате ряда экспериментов было установлено, что терминация каким-то образом запускает синтез специфической мРНК и белка, необходимых для деления клетки [200]. Таким образом, клеточный цикл состоит как бы из серий последовательно протекающих событий, каждое из которых «включает» следующее событие.

5. Репликация вирусной ДНК

Пытаясь найти по возможности более простые системы для изучения синтеза ДНК, многие исследователи обратились к мелким ДНК-содержащим вирусам типа ФХ174 и М13. Они не обошли при этом вниманием бактериофаги, снабженные отростками: фаги X, Т7 и Т4, а также плазмиду колицина Е-1. Преимущество этих систем состоит в том, что для них легче смоделировать репликацию ДНК в клеточных экстрактах, а кроме того, ДНК вирусов и