ения гистидина.

46

50

34 38 42

Волновое число Ю'3,см

Как и в случае полипептидов, свойства спектров поглощения полинуклеотидов отражают спектральные свойства их компонентов. На рис. 13-11 и 13-12 приведены спектры поглощения пуриновых и пиризо

_L

220

200

200

300 250

Длина волны,нм

Волновое число-Ю ,см~'

j I I I I I I LL..I

300 250 220

Длина волны, нм

РИС. 13-12. УФ-спектры поглощения аденозина (Л) и гуанозииа (Б). I — моиопрото-нированная форма аденозина (р/Са = 3,5); // — нейтральные формы; /// — моноанион

гуанозина (р/Са=9,2).

мидиновых рибонуклеозидов. Число отдельных электронных переходов точно не известно, а их природа далеко не очевидна, несмотря на многочисленные попытки расшифровать эти спектры и соотнести их между собой [36]. То же самое можно сказать и о флавинах, спектры поглощения которых содержат по меньшей мере четыре интенсивные полосы перехода (рис. 8-16) [37].

Если в белках максимум низкоэнергетической полосы поглощения соответствует Хс^280 нм, то для полинуклеотидов А,тах = 260 нм (38 500 см-1). При исследовании оптических свойств нуклеиновых кислот особенно важной характеристикой является гипохромный эффект. В то время как поглощение денатурированного полинуклеотида примерно равно суммарному поглощению его компонентов, при образовании двухцепочечной структуры с укладкой оснований одно над другим поглощение при 260 нм уменьшается на 34%. Это явление лежит в основе оптического метода исследования плавления полинуклеотидов (рис. 2-28). Физическая природа гипохромного эффекта кроется во взаимодействии тесно уложенных одно над другим пар оснований (стэ-кинг-взаимодействие) [38].

е. Разностная спектроскопия

Часто бывает необходимо исследовать изменения поглощения света белками или нуклеиновыми кислотами в зависимости от таких факторов, как рН, температура, ионное окружение и присутствие или отсутствие других взаимодействующих молекул. Поскольку происходящие при этом изменения спектров невелики, широко практикуется измерение разности двух спектров — «невозмущенного» спектра и спектра, снятого в присутствии «возмущающего агента». В роли последнего может выступать какой-либо реагент, добавленный в раствор (например, глицерин, D2O и т. д.), а также рН и температура. Разностный спектр, представленный на рис. 13-13,5, порожден связыванием каталитической субъединицы аспартат — карбамоилтрансферазы (гл. 4, разд. Г, 8) с ингибитором сукцинатом и субстратом карбамоилфосфатом [39]. Этот спектр характеризуется присутствием в области поглощения ароматических аминокислот двух пиков и широкого минимума. При надлежащей интерпретации (непременное условие!) такие разностные спектры могут дать представление об изменении в окружении ароматических аминокислот, входящих в состав данного белка [40].

Разностные спектры обычно регистрируют, пропуская два световых пучка через две строго выверенные кюветы: один из пучков — через кювету сравнения, другой — через кювету с образцом. Однако спектр, приведенный на рис. 13-13, Б, получен путем независимой регистрации двух спектров (с выводом данных на перфокарты) и последующего вычитания их один из другого с помощью вычислительной машины. Те же данные могут быть представлены и иначе: в каждую из полос поглощения вписывают логарифмически-нормальную кривую (разд. Б,

4, а), а затем наносят на график разность между сглаженной кривой и

экспериментальными точками, следующими с очень малым интервалом

[41], как это показано на рис. 13-13, В. Два графика, полученные таким

образом, выявляют тонкую структуру спектра. Это по существу иной

способ получения разностного спектра. Преимуществом указанного метода служит то, что проведенная с помощью ЭВМ аппроксимация кривой дает представление о форме самой полосы поглощения. Как не*

трудно видеть, связывание сукцината и карбамоилфосфата вызывает

слабый сдвиг (20 см-1) полосы поглощения и очень небольшое ее уширение. Основной эффект состоит в более четком выражении колебательной структуры 0—0-полосы при 34 600 см-1, обусловленной поглощением двух остатков триптофана, которые присутствуют в субъединице

фермента. Причина этого изменения, однако, не вполне понятна, в чем

и проявляется ограниченность метода разностной спектроскопии.

5. Круговой дихроизм и дисперсия оптического

вращения [42—45]

Круговой дихроизм образца обусловлен различием между молярными коэффициентами экстинкции для право- и левополяризованного света [уравнение (13-7]; он наблюдается только для хиральных молекул:

Де = eL—ек(М-1см-1). (13-7)

Значение Де может быть непосредственно измерено с помощью дихро-графа. Спектр кругового дихроиэма (КД) часто напоминает спектр поглощения данного образца, поскольку положение пиков для обоих случаев совпадает. Однако КД бывает как положительным, так и отрицательным, причем он может быть положительным для одногс Перехода и отрицательным для другого (рис. 13-8). Все более широко* применение находят графики, представляющие зависимость Де от дли

Свет в онологнн ли

ны вол