абораторных мышей, которые нуждаются в удвоенном по сравнению с нормой количестве витамина В6 и умирают в конвульсиях спустя короткое время после исключения витамина Вб из пищив.

а Snell Е. Е., Haskell В. Е. (1970). Compr Biochem., 21, 47—71. 6 Johansson S., Lindsiedt S., Tiselius H.-G. (1974). J. Biol. Chem., 240, 6040—6046.

B Mudd S. H. (1971). Fed. Proc Fed Am. Soc. Exp. Biol, 30, 970—976 r Bell R. R., Haskell В. E. (1971). Arch. Biochem Biophys., 147, 588—601. * Pascal T. A. Gaull G. Beratis N. G.. Gillatn В. M., Tallan H. H.t Htrschhorn K. (1975). Science, 190, 1209—1211.

2. Пиридоксальфосфат в роли катализатора

Как пиридоксаль, так и PLP при полном отсутствии ферментов способны не только вступать в реакции переаминирования с аминокислотами, но могут и катализировать многие реакции превращений аминокислот, идентичные реакциям, катализируемым PLP-зависимыми ферментами. Таким образом, сам кофермент можно рассматривать как «активный центр» ферментов и исследовать его в модельных неферментативных реакциях. Ранние модельные исследования позволили сделать следующие выводы о PLP [34]:

а. Альдегидная группа PLP легко и обратимо реагирует с аминокислотами с образованием шиффовых оснований (рис. 8-5). Шиффовы

основания реагируют далее с образованием различных продуктов.

б. Для того чтобы альдегид был катализатором, в орто- или параположении по отношению к —СНО-группе должна находиться сильная

электроноакцепторная группа, например кольцевой азот пиридина (как

в PLPJ. Нитрогруппа, которая также является сильным акцептором

электронов, может замещать пиридиновый азот в модельных реакциях:

сно СНО

1

О) вместо й

NO,

в. Наличие —ОН-группы по соседству с—СНО-группой значительно

повышает каталитическую активность. Поскольку ионы некоторых металлов, например Си2+ и А13+, увеличивают скорости реакций в модельных системах и, как известно, образуют хелаты (клешнеобразные аддукты) с шиффовыми основаниями, сходные с теми, которые получаются с

PLP, был сделан вывод, что либо ион металла, либо протон образует

хелатное кольцо и способствует стабилизации плоскостной конформации шиффова основания (рис. 8-5)[).

г. В модельных системах 5-оксиметильная и 2-метильная группы для

катализа не существенны. В то же время в ферментах 5-СН2—ОНгруппа необходима для прикрепления фосфатной «ручки». Теперь уже

известно, что у многих PLP-ферментов 2—СН3-группа не является необходимой для коферментной активности.

Дополнение 8-Е Нингидрин

Важный аналитический реагент, применяемый в биологических исследованиях, нингидрин (моногидрат индан-1,2,3-триона), подобно пиридоксальфосфату образует с аминокислотами реакционноспособные шиффовы основания (кетими' _ !) Однако у PLP-зависимътх ферментов Такая функция ионов металла не обнаружена.

Коферменты — природные специализированные реагенты Й13

ны). Декарбоксилирование кетиминов с последующим гидролизом образующихся альдиминов приводит к промежуточному амину, который может реагировать со второй молекулой нингидрина, давая характерное пурпурное Окрашивание3:

О О

Эта реакция широко используется в хроматографии и для количественного определения аминокислот (гл. 2, разд. 3,5). а-Аминокислоты реагируют в большинстве случаев легко, однако первичные амины и пептиды также образуют пурпурный краситель Руэманна. При этом из кетимина отщепляется не СО2, а протон. Если в реакцию вступает пиридоксамин, то на хроматограммах появляется ярко оранжевый продукт, вероятно альдимин. Вторичные амины, например пролин, дают желтую окраску.

Промежуточный амин может гидролизоваться до свободного аммиака. Для обеспечения максимального развития окраски в растворы нингидрина, предназначенные для количественного анализа, обычно добавляют гидриндантин (восста

новленный нингидрин), который может реагировать со свободным NH3 и нингидрином с образованием пурпурного Руэман-на (см. схему).

Как нингидриновая реакция, так и катализируемое пири-доксальфосфатом декарбоксилирование аминокислот являются примерами деградации, описанной Штрекером. В 1862 г.

О

Аллоксан

Штрекер сообщил, что аллоксан вызывает декарбоксилирование аланина до ацетальдегида, СОг н аммиака6. Многие другие карбоксильные соединения, например соединения с общей структурой

О

I II

0=С—(СН=СН)Л—С—

и гс-нитросалициловый альдегид, также вызывают штрекеровскую деградацию13.

а Friedman М, Williams L. D. (1974). Bioorganic Chem, 3, 267—280.

6 Strecker A (1862) Annalen, 123, 363—365

3. Основная функция пиридоксальфосфата

Рассмотрев различные известные PLP-зависимые ферменты, ответственные за метаболизм аминокислот, Браунштейн и Шемякин [35] в 1953 г. высказали предположение об общем механизме их действия. Предложенная ими теория находилась в полном согласии с результатами тогда еще неопубликованных модельных экспериментов, о которых упоминалось выше, и в дальнейшем получила полное подтверждение в исследованиях большого числа ферментов.

Общий механизм действия PLP можно упрощенно сформул