взаимная ориентация двух колец1* благоприятна для выполнения этой функции [25]. Однако аминогруппа тиамина не является сильно основной; в действительности центром прото-нирования при низких значениях рН (с р/Са ~4,8) служит в основном атом N-1 пирамидинового кольца (рис. 8-2). В протонированной форме основность —ТМНг-группы выражена еще слабее вследствие оттягивания электронов к кольцу. Таким образом, фермент может изменять основность —ЫНг-группы на разных стадиях реакции, влияя на протонирование кольца. Одна весьма умозрительная идея состоит в том, что фермент может стабилизировать минорный таутомер амино-пиримидинового кольца. Совместно с нуклеофильной группой он мог бы составить «систему переноса заряда», аналогичную описанной для химотрипсина (рис. 7-2). Ниже схематически представлена гипотетическая система «переноса заряда», посредством которой аминопирими-диновое кольцо тиамина могло бы способствовать удалению 2'-прото~ на тиазолиевого кольца:

Субстрат

Н * : B-denon

Пиримидиновое кольцо оказывает также большое влияние на основность тиазолиевого азота и может контролировать степень диссоциации С-2-протона [26].

1) Однако в кристаллах 2-а-оксиэтилтиамина — промежуточного соединения в катализируемом тиамнном распаде пирувата до ацетальдегнда — ориентация носит несколько иной характер [24].

Ферменты, зависимые от тиамина, как правило, нуждаются в двухвалентном металле, например Mg2+ или Мп2+; можно полагать, что главным центром связывания иона металла является пирофосфатная группа [27].

который идентичен соединению, изображенному в левой части уравнения (8-14). Декарбоксилирование а-кетокислоты до альдегида представлено стадией б с последующей реакцией в направлении, обратном стадии а. Наиболее изученным ферментом, катализирующим реакцию этого типа, является пируватдекарбоксилаза дрожжей. Это нуждающийся в Mg2+ димерный фермент с мол. весом ~ 200 ООО [28]. Тиамин-дифосфат и Mg2+ отщепляются от фермента при рН 8, однако активный фермент можно реконструировать при рН ниже 7.

Образование а-кетолов из а-кетокислот также начинается со стадии б, за которой следует конденсация с другим карбонильным соединением, осуществляемая обращением стадии в. Хорошо изиестным примером такой реакции служит синтез а-ацетолактата

О ОН II I

НдС—С—С—СНд, СОО"

а-Аде тол актат в котором сочетаются декарбоксилирование пирувата и конденсация образующегося активного ацетальдегида с другой молекулой пирувата. Эта реакция катализируется ацетолактатсинтетазой, которую иногда именуют «карбо-лиазой». Ацетолактат служит предшественником ва-лина и лейцина (рис. 14-10). Сходная кетольная конденсация необходима и в биосинтезе изолейцина (рис. 14-10). Ацетолактат является

СН2ОН

I Р ^Н,

—? н—с=о -I- с=о

НО—С— R ОР032R Ацетилфосфат

ADP АТР^

сн3—соо~

РИС. 8-4. Расщепление а-кетола до альдегида и карбоновой кислоты; последовательность реакций, сопряженная с фосфорилнрованием ADP (реакция типа S7A).

р-кетокислотой и легко декарбоксилируется в ацетоин; эта реакция имеет важное значение при некоторых видах бактериального брожения [уравнение (9-28)]. Кетольная конденсация двух молекул глиоксилата с декарбоксилированием катализируется глиоксилат-карболигазой (гл. 9, разд. В, 2).

Другой путь ферментативного синтеза кетолов состоит в расщеплении альдегида (стадия а) с последующей конденсацией со вторым альдегидом (стадия в в обратном направлении). а-Дикетоны могут расщепляться (стадия г) на карбоновую кислоту и активный альдегид, который далее подвергается превращению в реакции, соответствующей стадии а или стадии в в обратном направлении. Эти и другие сочетания стадий часто наблюдаются как побочные реакции при действии таких ферментов, как пируватдекарбоксилаза. Родственной реакцией, зависимой от тиамина, является реакция между пируватом и ацетил-СоА, ведущая к образованию а-дикетона, диацетила СН3СОСОСН3 [29]. Эту реакцию можно рассматривать как замещение СоА-аниона из ацетил-СоА в результате атаки связанным с тиамином активным альдегидом, образовавшимся из пирувата (обращение стадии г на рис. 8-3 с высвобождением СоА).

Стадия д на рис. 8-3 представляет собой реакцию расщепления производного ацилдигидролипоата. Реакция обычно протекает в обратном направлении и является частью процесса окислительного декарбоксилирования а-кетокислоты, который начинается стадией б (см. разд. К).

Важное значение имеет реакция расщепления сс-кетолов, в которой используется стадия в (рис. 8-3) с последующим обращением этой же стадии, но с другим акцептором альдегида. Эту реакцию катализирует транскетолаза [уравнение (9-15)]—фермент, необходимый в пентозо-фосфатных путях метаболизма и в фотосинтезе. Родственная реакция (рис. 8-4), которая имеет более сложный механизм, катализируется-ферментом фосфокетолазой; эта реакция играет важную роль в энергетическом метаболизме некоторых бактерий. Продуктом реакции, ка

тализируемой фосфокетолазой, является ацетилфосфат, расщепление которого может быть сопряжено с синтезом АТР (рис. 8-4).

М