илом [22]:ЙГ"*+ [А] + [В] + [А][В] •

Суммарная концентрация фермента обычно равна vtfkt [см. уравнение (6-6)]. ИЭ уравнения (6-356) следует, что q>o—l/*f. причем для схемы (6-34) k% может быть ПРИравнена в некоторых случаях константе к§.

Л J ^ j_

А [А] Б [В] В [В]

PHCj 6-5 Графики двойных обратных координат, используемые для анализа кинетики двухсубстратных ферментативных реакций. А Серия зависимостей \(Щ от 1/[А] при различных фиксированных концентрациях второго субстрата (В). Б Вторичный график зависимости длины отрезка, отсекаемого на оси ординат прямыми в координатах (1/ff; 1/[А]}, от 1/[В] В Вторичный график зависимости наклона первичных зависимостей, представленных на рис А, от 1/[В]. Все зависимости рассчитаны с помощью уравнения (6-35а) при следующих значениях параметров Км\=\0~3 М, КМВ«2/Сма, /CAB=/CeqA/CMS=/CMA/200, [А]^[В] = 1 М В качестве первичных графиков можно использовать также графики Эдн — Хофсти, т е графики зависимости V:/[A] -от VJR построенные при постоянных концентрациях субстрата В Читатель без особого труда может преобразовать уравнение {6 35а) к линейной форме типа (6 20)

руют, например, концентрацию субстрата А, поддерживая концентрацию В постоянной. Затем фиксируют концентрацию субстрата А и варьируют концентрацию субстрата В. Каждая серия подобных экспериментов дает семейство прямых (рис. 6-5,Л), для которых находят наклоны и отсекаемые на оси ординат отрезки. Далее строят зависимость наклонов и отсекаемых отрезков от обратной концентрации того субстрата, концентрация которого в каждой из серий экспериментов поддерживалась постоянной.

Из этих вторичных графиков можно определить значение Vt и одной из констант Михаэлиса (рис. 6-5,? и В). Два набора вторичных графиков позволяют найти все константы уравнения (6-356) (однако при этом произведение К&цкКмъ рассматривается как одна константа КАВ). Кинетические параметры можно определить и с помощью численных методов, которые дают возможность обрабатывать сразу все данные и получить оптимальные значения параметров. Преимущество этого подхода состоит в том, что он позволяет надежно оценить стандартные отклонения для найденных значений параметров [1].

Некоторые кинетические параметры имеют ясный физический смысл. Параметр Vf—это скорость, достигаемая при условии, когда концентрация субстрата А и концентрация субстрата В бесконечно высоки. Каждая константа Км. соответствует константе Михаэлиса для простой системы, в которой концентрация второго субстрата достаточно высока, чтобы насытить фермент.

Для рассмотренной выше бимолекулярной реакции справедливы два следующих соотношения Холдейна1':

Aeq ~ УгКаХКмв ~~ \ ) Кмд^ав ' 1 ;

Из этих двух соотношений обычно используется только первое.

1 \ ч

J> Входящие в эти соотношения коцстанты задаются следующими соотношениями (см, например, Segel I Н Enzyme kinetics, J Wiley and Sons, New York, 1975, p. 5641»

"10

MB - kt (*A+Me+ V5+ hh) *

' k2kt -f- k2kb -f- k2k6 -f kjka

*dB~ k9(kb+k6)

V _ rPi k7kSkb

VI ~ I*1" kih+ kgku+ ks)k6 .

K hhK6

K _ ft2 (^4fe7+ Ms)

AMP ~ ka (k2kA + k2kb + k2kt+ ktkt)'

k^kf + feyfeg -f fegfe5 + k9ke

v _rEU ЬМй

Заметим также, что константа Клл ранее обозначалась автором как — Прим. перев.

А. Механизмы типа «пинг-понг»

Особенно распространенным механизмом для ферментативных реакций, протекающих с участием кофермента, является так называемый механизм типа пинг-понг; отличительной чертой его является то, что фермент находится то в форме Е, то в форме Е':

Р В Q

H I *в K7 I H K ?ц f ?12

Е'Р —J EJ -Л Е'В EQ ! Е. (6-37)

Механизм типа пинг-понг для реакции между А и В, приводящей к образованию Р и Q

Взаимодействие фермента с субстратом А приводит к образованию формы Е' через комплекс ЕА. Е' — это модифицированная форма фермента, в которой кофермент часто оказывается химически модифицированным (примером может служить реакция переаминирования; гл. 8, разд. Д, 1). Одновременно субстрат А превращается в продукт Р, все еще связанный с ферментом. Отщепление продукта Р приводит к высвобождению формы Е', которая затем может взаимодействовать со вторым субстратом, В, и проходить вторую половину цикла с превращением формы Е' в форму Е.

Уравнения скорости для механизма типа пинг-понг напоминают по форме уравнения скорости для бимолекулярной реакции с упорядоченным присоединением субстратов (6-35а) и (6-356), однако каждое из них содержит на один член меньше'):

Vt [А] [В] б_3.

Щ -*мв ГА] + *ма [В] + [А] [В] •

Соответственно из кинетических данных получают в этом случае на один кинетический параметр меньше, чем для реакций с упорядоченным присоединением субстратов. Кинетическая схема (6-37) для ферментативной реакции, протекающей по механизму типа пинг-понг, содержит 12 кинетических констант. Это соответствует минимальному числу стадий, которые необходимо рассмотреть, чтобы описать кинетические свойства фермента, функционирующего согласно механизму типа пин