ие

Эфир фосфорной кислоты енольной формы пирувата, обычно называемый просто фосфоенолпируватом (PEP),

coo^ II .

сн,

занимает центральное положение в метаболизме. Фосфоенолпируват образуется в результате дегидратации 2-фосфоглицерата [уравнение (7-46)] в гликолитическом пути или в результате декарбоксилирования оксалоацетата. Это соединение используется во многих реакциях метаболизма, выступая в роли исходного енола, дающего начало реакцион-носпособному енолят-иону, участвующему в реакциях конденсации. Его место в метаболизме будет рассмотрено более полно в последующих главах, а в этой главе мы обсудим те превращения, которые приводят к образованию фосфоенолпирувата в результате декарбоксилирования оксалоацетата. Эта реакция, играющая в метаболизме животных, других высших организмов и бактерий первостепенную роль, катализируется фосфоенолпируват-карбоксикиназой. Молекула гуанозинтрифосфата или инозинтрифосфата захватывает и фосфорилирует енолят-аиион, образующийся при декарбоксилировании:

COO Q 0 чр_0_гутюзин -ООС-^-С ОН^р'с/ (GTP)

о' о\ (7-76)

со, \

COO'

Н.С=С/ + GDP

si-Сторона 4Q —РП Н

обращена п читателю

Стереохимия этой реакции такова, что С02 отщепляется с si-стороны

образующегося енола. Другой фермент, фосфоенолпируват-карбокситрансфераза, катализирует следующую реакцию декарбоксилирования:

Оксалоацетат-f-P^j *? Фосфоенолпируват -j- C02 -f- Pi (7-77)

Этот фермент обнаружен только в клетках пропионовокислых бактерий и у Entamoeba. По-видимому, этот фермент обычно функционирует в обратном направлении, обеспечивая в этих организмах синтез оксалоаце-тата из фосфоенолпирувата. Гидролиз образующегося пирофосфата, очевидно, «тянет» реакцию в требуемом направлении [162].

Оксалоацетат может также подвергаться ферментативному декарбоксилированию в пируват [см. реакцию (9-8)], протекающему, вероятно, через образование енолят-аниона, но без стадии фосфорилирования, изображенной на схеме (7-76). Фермент пируваткиназа (гл. 9, разд. Д,1), который обычно катализирует образование пирувата в енольной форме, по-видимому, идентичен оксалоацетатдекарбоксилазе [162а].

д. Двуокись углерода или бикарбонат-ион?

При рассмотрении реакций карбоксилирования и декарбоксилирования возникает вполне уместный вопрос: является ли исходным реагентом (или продуктом) С02 или НСОз? Первую попытку ответить на этот вопрос сделали Кребс и Рафтон [163], показавшие, что равновесие между свободным С02 и НСОз:

C02-f-H20 ^L±L H2C03 zj=Ј H+4-HCOJ (7-78)

устанавливается не мгновенно, а на протяжении нескольких секунд. Если какой-либо фермент катализирует образование С02 в качестве продукта реакции, то, следя за реакцией манометрически, можно увидеть, что давление нарастает, постоянно превышая равновесное значение соответственно количеству выделяющегося С02. Однако позднее, когда весь субстрат будет израсходован и между С02 и НСОз установится равновесие, давление вновь уменьшается. Этот «перехлест» можно устранить добавлением карбоангидразы, катализирующей реакцию (7-78,а). Если бы первичным продуктом реакции декарбоксилирования был бикарбонат, то на кривых, описывающих кинетику накопления свободного С02, должен был появиться лаг-период.

Второй подход к изучению обсуждаемой проблемы заключается в использовании 1вО-бикарбоната и регистрации включения lsO в карбокси-лированный субстрат. Если первичным субстратом служит С02, то в образующееся соединение войдут только два меченых атома кислорода, если же реакция начинается с НСОз — три атома кислорода [164]. Третий подход заключается в измерении скоростей включения С02 и бикарбоната в продукт карбоксилирования. На протяжении короткого интервала времени (порядка 1 мин) кинетика включения СОг и бикарбоната будет различной [165].

При помощи этих методов было установлено, что продуктом реакций (7-76) и (7-77) является С02. Между тем другие ферменты карбоксилирования, рассматриваемые в следующем разделе, используют в качестве субстрата бикарбонат.

е. Включение бикарбоната в карбоксильные группы

Фосфоенолпируват-карбоксилаза, катализирующая реакцию

О

II

НССХГ + PEP * "ООС—С—СН2—СОО" + Я„ (7-79)

является важным ферментом, выполняющим биосинтетические функции у многих бактерий и растений. Этот фермент фактически катализирует реакцию, обратную той, которая описывается уравнением (7-76), превращая трехуглеродную молекулу фосфоенолпирувата в содержащий четыре атома углерода оксалоацетат. Последний необходим для «запуска» цикла трикарбоновых кислот и для биосинтеза таких аминокислот,, как аспартат и глутамат. О наличии именно такого механизма действия этого фермента свидетельствует тот факт, что мутант Salmonella, в котором образования этого фермента не происходит, не растет до тех пор,, пока в среду не будет добавлен оксалоацетат либо другое промежуточное соединение цикла трикарбоновых кислот. Фермент из 5, typhimuri-um представляет собой тетрамер с мол. весом ~ 400 ООО и обладает сложными регуляторными свойствами. Соответствующий