уппу. Из Aspergillus niger был выделен фермент ок-салоацетат—ацетилгидролаза [141]:

НО- О ||^ У<->С-ОН

'ООС С

н2

Оксалоацвтат-маноанион

"ООС—СООН + СНз—СООН

Оксалат Уксусная

(моноанион) кислота \'~°ч

Лучше изучены тиолазы [142, 143]. Одна из функций этих ферментов состоит в расщеплении р-кетоацилпроизводных СоА, происходящем путем замещения тиоловой группы другой молекулой СоА:

О О

С С

X S—СоА Н2

Тиолаза

О

О

R—С—SCoA + СНз—С—SCoA (7-62) Ацетип-СоА

Эта реакция является одной из стадий разрыва цепи в последовательности реакций Р-окисления жирных кислот, приводящих к их распаду (рис. 7-1). Поскольку тиолазы ингибируются реагентами на —SH-rpyn-пы, было высказано предположение, что тиоловая группа, входящая в состав фермента, первоначально реагирует с р-карбонильной группой, как показано в уравнении (7-62), приводя к образованию промежуточного соединения. Затем на второй стадии ацильная группа переносится к СоА. Некоторые тиолазы могут образовывать шиффовы основания со своими субстратами [143].

2. Присоединение енолят-аниона к карбонильной группе или к иминам (реакции типа 5.Б.)

Альдольная конденсация является одной из наиболее типичных реакций в метаболических процессах, приводящих к образованию связей С—С (при протекании обратной реакции) к их расщеплению:

Оi / I —c=c + c=o + н+ —>

\ I

о

II I 1

— С—С — С—ОН (7-63)

I I

а. Фруктозодифосфат-альдолаза

Наиболее известная альдолаза расщепляет (обратимо) в гликоли-тическом пути фруктозодифосфат на две молекулы триозофосфата:

СН2О ®

С=О ^

носн

I

неон

СН2О (Р) СНО

I w I

—* С=О + НС—ОН

СН2ОН СН2О ®

НСОН Диокси- ь-глицер1 _ ацетон- алъдегиЬСН20 (Р) фосфат 3-фосфат

Фруктоза- (7-64)

ЭТОТ фермент обнаружен во всех растительных и животных тканях, но он отсутствует в некоторых бактериях, приспособленных к определенным условиям. Хорошо изученная альдолаза из мышц кролика представляет собой белок с мол. весом ~ 160 ООО; это тетрамерная молекула, состоящая из четырех почти идентичных полипептидных цепей [144—146].

Обработка фермент-субстратного комплекса альдолазы с диоксиаце-тонфосфатом боргидридом натрия при рН 6 (0°С) приводит к образованию ковалентной связи между белком и субстратом. Эти и другие данные свидетельствуют о промежуточном образовании шиффового основания (рис. 7-10). Использовав меченный 14С субстрат и восстановление боргидридом натрия [уравнение (7-41)], получили фермент, у которого был помечен лизин активного центра. Локализацию радиоактивной метки определяли анализом последовательности аминокислотных остатков и установили, что остаток меченого лизина занимает положение 227 в цепи, состоящей из 361 аминокислоты.

Присутствие существенного для проявления ферментативной активности остатка гистидина в активном центре фермента подтверждается экспериментами по фотохимическому окислению. Например, облучение видимым светом в присутствии галоидированного флуоресцеинового красителя бенгальского розового приводит к фотоинактивации альдолазы, сопровождающейся разрушением большого числа гистидиновых остатков. Более избирательным реагентом является пиридоксальфосфат (гл. 8, разд. Д), который связывается в активном центре, образуя, по-видимому, шиффово основание со вторым остатком лизина. При облучении связанного с ферментом пиридоксальфосфата в каждой субъединице разрушается один-единственный остаток гистидина (вероятно, His-359).

Реакция 5,5'-дитио-би?-2-нитробензоата [реактив Элмана; схема (2-28)] с альдолазой вызывает быстрое блокирование одной —SH-группы в каждой субъединице. Присутствие субстрата мешает протеканию реакции, откуда следует, что в активных центрах находятся и SH-группы (по-видимому, Cys-72 и Cys-336). Имеются и TAIL*

РИС 7-10 ВОЗМОЖНЫЙ механизм действия фруктозо-1,6-дифосфат—альдолазы.

кие данные, из которых следует, что карбоксильная группа концевого Туг-361 располагается в активном центре или вблизи от него [146].

На основании этих данных Лей и Хореккер [145] предложили гипотетическую последовательность химических превращений, происходящих в активном центре альдолазы (рис. 7-10). Как показано на этой схеме, фермент катализирует раскрытие циклической формы фрукто-зодифосфата, причем в этой реакции, возможно, участвует фосфатная группа субстрата [147]. Реакция р-расщепления может быть инициирована —5>~-группой. Предполагается, что имидазольная группа активного центра служит донором протона, который, как было показано, присоединяется к тому же положению (стереохимически), какое занимала связь между атомами углерода в фруктозо-1,6-дифосфате. Высказано предположение, что перенос протона имидазольной группы осущеLnuoi реакции, катализируемых ферментами 165

ствляется внутри гидрофобной области фермента, как описано в гл. 2 (разд. А.9).

Альдолаза является одним из ферментов, проявляющих особую склонность к взаимодействию с тетранитрометаном. Это соединение реагирует относительно м