ет быть образование фосфофермента, в котором фосфатная группа присоединена к атому N3 боковой цепи остатка гистидина, принадлежащего а-субъединице тетрамера агрг [88,

88а, Ь].

Синтез глутамина, катализируемый глутаминсинтетазой, вероятно, протекает по типу SlC(y). Однако прямых доказательств образования предполагаемого промежуточного продукта у-глутамилфосфата пока не имеется. Парциальные реакции изотопного обмена, которые в случае такого синтеза, по-видимому, должны были бы иметь место, не наблюдались [89]. Очевидно, образующийся в качестве промежуточного соединения ацилфосфат является короткоживущим соединением, и все три реагента должны одновременно присоединиться к ферменту прежде, чем активный центр станет способным к функционированию. О том, что образование ацилфосфата действительно происходит [90, 91], свидетельствует выделение внутреннего амида глутаминовой кислоты 5-оксопро-лина (пнрролидонкарбоновой кислоты) и восстановление промежуточного продукта боргидридом натрия в спирт:

(7-31)

Поскольку прямое доказательство образования ацилфосфатов как промежуточных продуктов оказалось делом нелегким, было высказано предположение, что глутаминсинтетаза и некоторые другие ферменты, катализирующие реакции множественного замещения, могут обусловливать «полностью согласованную» реакцию. В этом случае обе стадии замещения должны протекать одновременно через единое «ключевое переходное состояние», как показано на приведенной ниже схеме для глутаминсинтетазы:

(7-32)

юо i лава /

Однако до сих пор не получено ни одного сколько-нибудь убедительного довода в пользу существования такого механизма для какой-либо химической реакции. По-видимому, гораздо более вероятно, что ферментативные реакции протекают через ряд дискретных стадий.

4. СоА-трансферазы

Часто возникает следующая проблема переноса энергии: в распоряжении клетки всегда имеется тиоэфир, например сукцинил-СоА, в нестабильной связи которого запасена энергия, необходимая для синтеза различных тиоэфиров. Клетка могла бы сначала синтезировать АТР или GTP в обратной тиокиназной реакции, а затем использовать образовавшиеся АТР и GTP для синтеза новой связи при участии опять-таки тиокиназы. Однако имеются специальные ферменты, СоА-трансферазы, действие которых осуществляется более прямым путем:

С^кцинил-СоА + R—СООН ? R—С—СоА + Сущий am (7-33)

AG « О

Механизм действия этих ферментов точно не установлен. Каким образом СоА может переноситься от одной ацильной группы к другой, сохраняя при этом высокий потенциал переноса ацильной группы?

Следующие эксперименты проливают свет на этот вопрос. На основании изучения кинетики реакции, катализируемой сукцинил-СоА: аце-тоацетат — СоА-трансферазой, был сделан вывод о наличии пинг-понг-механизма (гл. 6). Таким образом, фермент представлен двумя различными формами, одна из которых, как было показано, содержит связанный СоА [92]. Промежуточное соединение фермент—СоА, образующееся при взаимодействии фермента и ацетоацетил-СоА, восстанавливали меченным 3Н боргидридом натрия, а затем при помощи НС1 осуществляли полный гидролиз ферментного белка. В результате была выделена тритированная а-амино-б-оксивалериановая кислота.

NH2

I

нон2с—сн2—сн2—НС—СООН

а-Амино-5-оксиаалериановая кислота

Поскольку тноэфиры, так же как и сложные эфиры, при действии бор-гидрида натрия расщепляются до спиртов (в результате двухстадий-ной реакции), было сделано заключение, что промежуточный продукт фермент—СоА представляет собой тиоэфир, образованный с участием карбоксильной группы боковой цепи глутаминовой кислоты [93]. Изучение реакций обмена, протекающих с меченным 180 сукцинатом, показывает, что 180 из сукцината переходит как в про межу трч^ое соединение фермент—СоА, так и в карбоксильную группу ацетоацетата [94].

Можно представить по крайней мере два механизма, лежащих в основе этого процесса. Первый включает образование промежуточного ангидрида и по своей механике подобен реакциям, которые обсуждались в предыдущих разделах [94а]. Студентам следует записать последовательно все стадии этого механизма. Можно ли, исходя из этого ме

ханизма, объяснить данные, полученные при изучении 180-обмена? Второй возможный механизм — реакция с участием четырех центров:

<Р /О

Е—С г ^ О/\ СоА ° R

О R

Хотя наличие механизмов этого типа в случае ферментативных реакций не доказано, они в принципе возможны.5. Конформационные изменения, индуцируемые фосфорилированием

Один из возможных результатов переноса фосфатной группы на функциональную группу белка состоит в индуцировании конфирмационного изменения в молекуле белка. Действительно, имеются данные, весьма убедительно свидетельствующие о наличии таких изменений при действии АТР-зависимых ионных насосов (гл. 5, разд. Б,2,в) и при мышечной работе (дополнение 10-Е). Конформационные изменения могут также возникать в результате фосфорилирования регуляторных центров белков. Вполне возможно, что фосфорилирование имидазоль-ной группы, соединенной водор