тсутствие второго субстрата [75]. Милдваи [67] высказал предположение, что эти фосфоферменты образуются в результате побочных реакций, свидетельствующих о существовании промежуточных метафосфаткых соединений.

Недавно описаны трехмерные структуры дрожжевой гексокиназы (рис. 7-5,Л) [76], фосфоглицераткиназы, состоящей из 355 аминокислотных остатков (рис. 7-5,5) [77] и аденилаткиназы (дополнение 3-А) [78]. Последний фермент, мол. вес которого составляет ~ 22 ООО, имеет среди всех известных киназ наименьший размер молекулы. Во всех трех случаях молекула белка состоит из двух долей (или, иначе, домеБ

РИС. 7-5. А. Схематическое изображение полипептидной цепи субъедииицы дрожжевой гексокииазы В. Место связывания глюкозы обозначено буквой G, а место связывания AMP — буквой А. Места связывания АТР в области между двумя субъединицами в различных типах кристаллов обозначены буквами Iu и Id (по Флеттерику и др. [76]). Б. Изображение молекулы фосфоглицераткиназы. Цилиндры, представляющие се-спи-ральные отрезки цепи, пронумерованы римскими цифрами, начиная с К-конца«. Стрелками представлены индивидуальные цепи в р-структуре и их направление. Стрелки обозначены буквами в алфавитном порядке, начиная с N-конца. Домен, связывающий АТР, находится в нижней части рисунка (по Блейку и Эвансу [77]).

нов). Для фосфоглицераткиназы и аденилаткиназы установлено положение АТР-связывающего центра. Оказалось, что две ближние к адено-зину фосфатные группы Ра и Рр связываются одним и тем же доменом (нижний домен А на рис. 7-5,Б), а концевая фосфатная группа АТР (Pv) попадает в щель между двумя доменами. Ион Mg2+ связывается с Ра и Рр так, как это показано на схеме (7-23).

Большой интерес в настоящее время вызывают протеинкиназы (гл. 6, разд. Е,2), которые катализируют перенос фосфатных групп от АТР к гидроксильным группам определенных остатков серина или треонина в

молекулах своих субстратов. Характерной особенностью центров фос-форилнрования в субстратных белках является присутствие остатка лизина или аргинина в положении, отделенном от серина или треонина только одним аминокислотным остатком [78а].

Планарный нитрат-ион по своему сильному ингибирующему действию, обусловленному прочным связыванием, и по ряду других свойств может рассматриваться как аналог переносимой фосфатной группы в ?тригональных бипирамидальных переходных состояниях [уравнение *{7-20)] для реакций, катализируемых киназами [78Ь]. Еще один ион, шредставляющий интерес как высокореакционноспособный аналог фос-«фат-иона,— это феррат-ион FeO*". Будучи сильным окислительным .агентом, феррат-ион сходен в то же время с фосфат-ионом по структуре .и кислотно-основным свойствам и может быть использован для модификации фосфат-связывающих центров [78с].

7. Ядерная релаксация, индуцированная парамагнитными ионами

Использование парамагнитных ионов (например, Mn2+, Си2+ или >Сг3+) для индукции ядерной релаксации в молекулах субстрата н ко-фермента, находящихся в активных центрах ферментов, является очень эффективным методом исследования. Область применения этого метода непрерывно расширяется [79—83]. Для этих целей могут служить так-.же флавиновые радикалы и избирательно вводимые иминоксильные спиновые метки. Парамагнитные ионы, как хорошо известно, оказывают влияние на магнитную релаксацию соседних ядер (см. дополнение 5-А). Так, небольшие количества Мп2+ в образце вызывают уширение линий, соответствующих 1Н, 13С и 31Р в обычных спектрах ЯМР.

Ценную информацию о ферментах можно иногда получить из анализа сигнала ЯМР протонов в воде (растворителе). Время релаксации протонов свободной воды обычно больше 1 с. Однако протоны координационно связанных молекул воды в ионе Мп(Н20)б+ характеризуются гораздо более высокими скоростями релаксации (значения Т\ и Г 2 порядка 10~5 с). Поскольку координационно связанные молекулы воды •обычно очень быстро обмениваются с молекулами окружающей среды, небольшое количество ионов марганца может вызвать существенное повышение скорости релаксации протонов всех молекул воды. При этом • с помощью подходящих методов можно наблюдать уширение линии протона в спектре ЯМР и изменения величин Т\ и Т2. Известно, что сила ноздействия парамагнитного иона на магнитную релаксацию соседнего ядра обратно пропорциональна межъядерному расстоянию в шестой степени. Принимая, что в гидратированном ионе Мп2+ расстояние между Мп2+ и Н равно 0,287±0,005 нм, можно найти количественные соотношения между изменениями величин Т\ и 72, с одной стороны, и чис-.лом молекул воды, входящих в координационную сферу связанного бельком иона металла в любой фиксированный момент времени, и скоростью «х обмена с молекулами растворителя, с другой стороны.

Хотя регистрация изменений магнитной релаксации ядер 1Н, 13С и 31Р наталкивается на еще большие трудности, подобные измерения могут дать чрезвычайно полезную информацию о геометрии активных центров. Расчеты опираются на ту закономерность, что воздействие на релаксацию ядра убывает с ростом межъядерного расстояния г пропорциона