ое расщепление фосфодиэфирных связей в молекуле РНК под действием рибонуклеазы протекает в две стадии. Расположен--ная по соседству гидроксильная группа в положении 2' рибозного коль, ца, по-видимому, депротоиируется при атаке основанием В (стадия а в уравнении (7-19).

Образующийся алкоксид-ион атакует затем фосфор, замещая кислород, соединенный с 5'-углеродом соседнего нуклеотидного звена. Последую, щее расщепление может облегчаться миграцией протона от кислой группы В'Н+. В качестве промежуточного соединения образуется циклический 2',3'-дифосфат, который затем гидролизуется молекулой воды на стадии б с образованием свободного З'-нуклеотида. Таким образом, суммарная реакция представляет собой процесс двухстадийного двойного, замещения, подобно тому как это имеет место в случае а-химотрипсина, с той разницей, что в роли нуклеофильного катализатора выступает соседняя группа в молекуле субстрата, а не боковая цепь аминокислоты.

Самый ценный вывод, который был сделан на основании данных, полученных методом рентгеноструктурного анализа, состоит в том, что основной группой, отщепляющей протон от 2'-гидроксила, является^ His-12, в то время как кислотная группа, отдающая протон уходящему 5'-кислороду, принадлежит His-119 [59]. (Любопытно, однако, что синтезированное производное рибонуклеазы с Мт-карбоксиметилированным остатком His-12 проявляет некоторую каталитическую активность — факт, в связи с которым возникает ряд вопросов [60].) Характер зависимости активности рибонуклеазы от рН согласуется с предложенным механизмом, поскольку найдены два значения р/Са (5,4 н 6,4), соответствующие двум группам, состояние ионизации которых контролирует активность фермента. (На основании ЯМР-спектров, показанных на рис. 2-42, было получено значение рКа, равное 5,8.) Вблизи двух остатков гистидина расположен остаток Lys-41. Возможно, его положительный заряд используется для частичной нейтрализации отрицательного заряда на атомах кислорода фосфатной группы, облегчая атаку иуклео-фильиым агентом. С точки зрения химии рибонуклеазы интересен тот-факт, что под действием бактериальной пептидазы отщепляется фрагмент, содержащий двадцать аминокислотных остатков. Этот «S-пептид». может воссоединяться с остальной частью молекулы с образованием активного фермента, называемого рибонуклеазой S. Структура этого. фермента была определена методом дифракции рентгеновских лучей и по существу оказалась аналогичной структуре нативной рибонуклеазы.

Методы белкового синтеза развиты в настоящее время в такой степени, что ферменты, молекулы которых имеют небольшие размеры, могут быть синтезированы в лабораторных условиях. Это дает возможность создавать новые модифицированные ферменты и критически анализировать роль различных групп активного центра. Так, например, установлено, что построенный из 70 аминокислотных остатков синтетический пептид, аналогичный рибонуклеазе S, но несущий ряд делеций и, совершенно не содержащий дисульфидных связей, все же сохраняет заметную каталитическую активность [61].

3. Пятиковалентные промежуточные соединения и пермутационные перегруппировки при замещении у атома фосфора

В то время как атом углерода способен образовывать только четыре -прочные ковалентные связи, фосфор может образовывать пять связей. Нуклеофильная атака атома углерода приводит к образованию неустойчивого (короткоживущего) переходного состояния с пятью связями, тогда как в результате атаки атома фосфора образуется пятиковалентное .

промежуточное соединение, которое может быть относительно стабильным и долгоживущим. Заметим, что наш обычный способ изображения зфиров фосфорной кислоты с двойной связью между атомом фосфора и одним из атомов кислорода обычно вводит в заблуждение. Все связи V—О обладают определенной степенью двоесвязанности, и фосфатная группа в целом проявляет свойства структуры, целиком образованной •одинарными связями:

I I

В уравнении (7-20) показано, как нуклеофильная группа Х- атакует тетраэдрическую фосфатную группу со стороны, противоположной группе О—R, с образованием пятиковалентного промежуточного соединения, геометрическая форма которого изображается тригональной бипирами-дой:

Вершинные положения

Экваториальные 'положения

°\ X 1 (7-20)

R

Тригональная бипирамиЬа

В этой структуре не все валентные углы одинаковы. Углы между связями, лежащими в экваториальной плоскости, составляют 120°, в то время как углы, образованные любой из этих связей и двумя связями, к которым присоединены группы в аксиальном (вершинном) положении, составляют 90°. Это неравенство углов вытекает из того простого факта, что невозможно разместить пять точек на поверхности шара так, чтобы все они находились на одинаковом расстоянии Друг от друга (в то время как четыре точки можно расположить на поверхности одного шара так, что они будут на одинаковом расстоянии Друг от друга, образуя тетраэдр). Если Х- атакует со стороны, противоположной О—R, это приводит к образованию тригональной бипирамиды, в которой —О—R и —X занимают два аксиальных п