ых конформациях, то возможна ситуация, когда изменение в распределении зарядов вызывает резкий переход из одного конформационного состояния в другое, причем подобный конформациО

О—Н'

Конфирмационный переход

онный переход может являться важной составной частью каталитического процесса.

При высоких значениях рН скорость действия химотрипсина падает, и характер рН-зависимости указывает на существование в активном центре группы с р/Са от ~8 до 9. Это значение р/Са может относиться к N-концевой аминогруппе Пе-16. Аминогруппа Пе-16 участвует в образовании одной из связей, расщепляемых при превращении зимогена в активный фермент. Эта аминогруппа образует ионную связь (ионную пару) с остатком Asp-194 (рис. 7-2), который находится рядом с сери-ном активного центра. Возможно, ионная связь способствует поддержанию фермента в нужной для реакции конформации. Депротониро-вание при рН выше 8—9 должно вызывать инактивацию [39].

Другая возможность состоит в том, что группа, имеющая высокое значение р/Са, принадлежит второму гистидину фермента — His-40. Однако этот гистидин отсутствует в бактериальной сериновой протеиназе, имеющей тот же самый тип рН-зависимости. His-40 расположен вблизи от остатка Asp-194 и связан водородной связью с пептидным карбони-лом. Считают, что он может играть определенную роль во взаимопревращениях зимоген — активный фермент.

д. Субстратная специфичность

Подобно большинству ферментов, трипсин и химотрипсин проявляют четко выраженную специфичность по отношению к определенным субстратам. Быстрое расщепление химотрипсином наблюдается в том случае, когда С = 0-группа расщепляемой пептидной связи принадле

жит одной из ароматических аминокислот. Таким образом, центр фермента, связывающий субстрат, должен иметь участок, осуществляющий связывание преимущественно больших, плоских ароматических групп. Анализ кристаллической структуры фермента показывает, что этот центр (рис. 7-2) состоит из гидрофобных боковых цепей аминокислот. В трипсине же участок активного центра, отвечающий за специфическое связывание субстратов, содержит фиксированный отрицательный заряд, обусловленный карбоксильной группой боковой цепи Asp-189. Этим объясняется тот факт, что трипсин расщепляет только те пептидные связи, к которым примыкают остатки аргинина или лизина, несущие в нейтральной среде положительный заряд [32].

2. Пепсин

Известно несколько различных семейств протеиназ, причем не все они обязательно содержат в активном центре серии. В одно из семейств входит пепсин желудка и родственные ферменты, например реннин из четвертого желудка (сычуга) теленка. Реннин вызывает быстрое свертывание молока и широко применяется в сыроварении. К этому же семейству относятся некоторые внутриклеточные катепсины и протеиназы различных грибов. Необычным свойством пепсинового семейства протеиназ является то, что они наиболее активны в интервале рН от 1 до 5. Это свойство делает понятным, почему серии и гистидин не входят в состав активного центра этих ферментов. Считают, что у «кислых» протеиназ в механизме двойного замещения роль нуклеофила выполняет карбоксилат-ион, а донором протона по отношению к уходящей группе служит вторая карбоксильная группа. Таким образом, механизм действия пепсина подобен механизму действия лизоцима.

Дополнение 7-В

Ингибиторы протеиназ животных и растений

Преждевременное превращение таких проферментов, как трипсиноген, в активные протеиназы в поджелудочной железе может иметь губительные последствия. Чтобы предотвратить такую преждевременную активацию, поджелудочная железа должна вырабатывать также специфические ингибиторы. Панкреатический ингибитор трипсина представляет собой небольшой белок с мол. весом 6500, специфически связывающийся в активном центре трипсина (/Cf=1012 М в щелочной среде)2. Определение кристаллической структуры самого трипсина и его ингибитора показало, что эти две молекулы плотно прилегают друг к другу6. Ингибитор связывается таким образом, как будто он является пептидным субстратом; один край молекулы ингибитора образует антипараллельную р-структуру с пептидной цепью фермента. Лизин-15, образующий часть этой р-структуры, входит в специфический связывающий центр для основной аминокислоты субстрата. Таким образом, ингибитор протеиназы представляет собой модифицированный субстрат, который фактически может подвергаться атаке в активном центре. Однако подгонка двух молекул является настолько тесной, что молекула воды не может участвовать в завершающей стадии каталитического акта, и комплекс остается не-реакционноспособным. (В тонкой кишке количество ингиби8—1896

тора не так велико, чтобы воспрепятствовать действию больших количеств трипсина, образовавшегося из химотрипсино-гена.)

Ингибиторы протеиназ, блокирующие действие трипсина,, найдены также во многих растениях. Обычно наиболее высокая антипротеиназная активность обнаруживается в семенах и клубнях, но синтез ингибиторов протеиназ может быть индуцирован и в других частях растений повреждением поверхности. Возможно, э