адающихся.

г. Трехмерная структура

В настоящее время структура химотрипсина и трипсина расшифрована благодаря использованию метода дифракции рентгеновских лучей [29—32J, подтвердившего предположения, сделанные на основании химических исследований. Как Ser-195, так и His-57 находятся в активном центре ферментов (рис. 7-2). Следует иметь в виду, что метод Дифракции рентгеновских лучей кристаллом фермента не дает возможности обнаружить положение атомов водорода в молекуле фермента и что на рисунке они проставлены согласно химической логике. Так, короткое расстояние (0,30 нм) между азотом остатка His-57 и кислородом остатка Ser-195 свидетельствует о наличии водородной связи. Аналогичные рассуждения привели к выводу о присутствии других водородных связей, показанных на рисунке. Если гистидин находится в непро-тонированной форме, а гидроксильная группа серина протонирована, то мы видим, что гистидин может выступать в роли акцептора протона от —СНгОН-группы серина (т. е. в роли общего основного катализатора), повышая нуклеофильность кислорода гидроксильной группы.

Исследования по дифракции рентгеновских лучей показали, что His-57 образует также водородную связь с карбоксильной группой ос1 IV

i JJdbd /

татка Asp-102, которая в свою очередь образует водородные связи с двумя другими группами. Карбоксильная группа боковой цепи остатка Asp-102 является одной из немногих карбоксильных групп, замаскированных в глубине белковой молекулы. Блоу [29] считает, что в такой структуре должна иметься система переноса заряда (a charge-relay system), с помощью которой протоны могут синхронно перемещаться от Ser-195 к имидазолу и от имидазола к Asp-102. Значение этой системы для сериновых протеиназ полностью еще не установлено, но этот вопрос следует рассматривать в свете концепции «таутомерного катализа» (гл. 6, разд. Д,5, е). Возможно также, что перенос заряда обусловлен смещениями электронной плотности в пептидной цепи. То обстоятельство, что такая же система переноса зарядов в ходе эволюции возникла в другой, в остальном совершенно отличной по действию сериновой про-теиназе, субтилизине (из Bacillus subtilis), позволяет сделать заключение, что эта система может действительно иметь существенное значение для механизма ферментативного катализа [33, 34].

Прямые наблюдения методом ЯМР протона, участвующего в образовании водородной связи между His-57 и Asp-102, подтверждают концепцию о переносе заряда [35]. Однако попытки сконструировать эффективную неферментативную модель, включающую систему переноса заряда, оказались безуспешными [36].

Повышение нуклеофильности гидроксильной группы серина — не единственная возможная роль остатка His-57. Группа R'—NH-, вытесняемая из субстрата, является плохой уходящей группой, если ее не перевести в протонированную форму (общий кислотный катализ):

^.Ser 195

His 57.^4 ? ^/Cx\ (7-15)

T> > °

H R'

Как указывал Дженкс [37], часто бывает трудно провести различие между общим основным и общим кислотным катализом. Возможно, His-57 выполняет сразу обе функции, сперва оттягивая протон от гид-роксильной группы серина, а затем отдавая протон уходящей группе [13, 38].

Другой вероятный механизм участия фермента в реакции замещения у карбонильной группы состоит в протонировании карбонильного кислорода кислотной группой фермента:

Н Н

R—N—С—R' > R— N—С— R' < *

II II

нв— h+b-_

R-N-C-R' (7.16)

°Н:ВЭто должно привести к значительному увеличению положительного заряда атома углерода, что в свою очередь должно облегчить нуклеофиль-ную атаку. Такое взаимодействие должно также стабилизировать тетра-эдрическое промежуточное соединение [уравнение (7-13)]. Карбонильный кислород проявляет очень слабую основность, но он может прото-нироваться подходящим образом ориентированной кислотной группой фермента [НВ в уравнении 7-16)]. В сериновых протеиназах эта функция, очевидно, выполняется двумя NH-группами амидных связей, одна из которых в химотрипсине принадлежит остатку Ser-195 (рис. 7-2). По-видимому, подгонка субстрата к полости оксианиона между двумя NH-группами хорошо выполняется только для тетраэдрического промежуточного соединения [33].

Было высказано предположение [38], что образование тетраэдрического оксианиона (с зарядом, передаваемым от замаскированного кар^ боксилата остатка Asp-102 к субстрату) инициирует конформационный переход, благодаря которому при распаде тетраэдрического промежуточного соединения имидазольная группа остатка His-57 получает возможность принять обратно протон от Asp-102 и протонировать уходящую группу [уравнение (7-17)].

Почему происходит конформационное изменение? В молекуле фермента имеется сложная сеть водородных связей. Появление отрицательного заряда на атоме кислорода тетраэдрического промежуточного соединения должно обязательно повлиять на распределение электронных плотностей внутри некоторых водородных связей, отдаленных от активного Центра. Если молекула белка может существовать в нескольких энергетически эквивалентн