опилфторфосфат (ДФФ), инактирует химотрипсин.

СН3 О

! II

СН3 —СН —О—Р—F

о

I

СНз—СН СН3

Диизопропилсрторсросфат.

Если на химотрипсин воздействовали диизопропилфторфосфатом, меченным 32Р, то 32Р оказывался прочно связанным с ферментом ковалент-ной связью. Дальнейшие эксперименты показали, что при денатурации меченого фермента и последующем его гидролизе кислотой высвобождения 32Р не происходит. Образующийся радиоактивный фрагмент был

О СОСГ

li I

"О—32 Р—О—СН2—С—NH3+

I н

НО

О-фосфОсерин

идентифицирован как О-фосфосерин. С химической точки зрения реакция между диизопропилфторфосфатом и химотрипсином протекает просто и состоит в следующем.

Гидроксильная группа боковой цепи серинового остатка атакует молекулу диизопропилфторфосфата у атома фосфора, замещая атом фтора. Заметим, что эта реакция представляет собой реакцию нуклеофильного замещения у атома фосфора (реакция типа 1.В, табл. 7-1), но в этом случае она протекает на ферменте, обычно катализирующем реакцию замещения у атома углерода карбонильной группы. Молекулу диизопропилфторфосфата можно рассматривать как псевдосубстрат (квазисубстрат), который реагирует с ферментом аналогично настоящему субстрату, но который не обеспечивает нормального завершения реакции.

На основании изучения пептидов, образующихся при частичном гидролизе меченного 32Р химотрипсина, была определена последовательность аминокислот, окружающих реакционноспособный остаток серина, и в конечном счете было установлено, что в общей последовательности цепи этот остаток серина занимает положение 195. Предшествующие положения (193 и 194) занимают глицин и аспарагиновая кислота, а в положении 196 находится еще одна молекула глицина

о-®

Gly-Asp-Ser-Gly 195

Такая же последовательность аминокислот в окружении реакционноспо-собных остатков серина была вскоре обнаружена в трипсине, тромбине, эластазе и трипсиноподобном ферменте коконазе, используемом тутовым шелкопрядом для освобождения из кокона [27]. Близкая по химической структуре последовательность, содержащая Glu-Ser-Ala, была обнаружена в ацетилхолинэстеразе. Таким образом, существует семейство сериновых пептидаз и эстераз, для которых характерна общая последовательность аминокислот вокруг реакционноспособного серина и способность ингибироваться диизопропилфторфосфатом [28].

б. Промежуточное соединение ацилфермент Другой псевдосубстрат, п-нитрофенилацетат,

о

ch3-c~o^O)~NOz

п-Нитпрофенилацетат

реагирует с химотрипсином при рН 4 (гораздо ниже рН-оптимума скорости реакции гидролиза) с быстрым выделением /г-нитрофенола и образованием ацетилпроизводного фермента. Образующийся ацетилфер-мент очень медленно гидролизуется при рН 4, но гораздо быстрее при более высоких значениях рН. Эти эксперименты позволяют предположить, что химотрипсин, подобно сахарозофосфорилазе, действует по механизму двойного замещения:

вR-C^ R~C О

/ O-R' в > R-C^ + I

I H+ HOR' i ОН Фермент

Фермент . Фе^ент (7-14)

Ашнирермент

Что представляет собой группа —В- в этом уравнении? Опыты с диизопропилфторфосфатом указывают на то, что —0~-группа принадлежит Ser-195. Однако этому предположению противоречит очень слабая кислотность —СН2ОН-группы. Кроме того, согласно другим данным, роль группы —В~ выполняет имидазольная группа гистидина. Например, известно, что каталитическая активность химотрипсина при гидролизе сложных эфиров меняется с изменением рН. В то время как конТипы реакций, катализируемых ферментами iuy

станта Михаэлиса мало меняется с изменением рН, зависимость Vmax от рН графически представлена типичной колоколообразной кривой (рис. 6-13) с оптимумом между рН 8 и 9. Из характера кривых для ряда различных эстераз найдены два значения рКа: одно из них находится между 6,1 и 6,8, а второе — между 9,0 и 9,6. Значение рКа, лежащее между 6,1 и 6,8, логичнее всего было бы приписать имидазольной группе гистидина, которая в каталитически активной форме фермента находится в непротонированном состоянии. Имеются и другие эксперименты, указывающие на участие в каталитическом процессе остатка гистидина. Например, химотрипсин реагирует с 2,4-динитрофторбензолом, и атака этим реагентом одного из двух остатков гистидина в молекуле фермента приводит к его инактивации.

в. Неферментативные модели

Было показано, что соединения, содержащие имидазол, катализируют неферментативный гидролиз я-нитрофенилацетата с образованием в качестве промежуточных продуктов нестойких ацетилимидазолов:

О

Было очень соблазнительно допустить, что ацилферментные промежуточные соединения, представленные в уравнении (7-14), могут иметь такое же строение. Таким образом, имелось два кандидата на роль группы —В: серин и гистидин. Хотя не вызывало сомнения то, что стабильные конечные продукты реакции с псевдосубстратами — это, несомненно, производные серина, все же оставалась возможность, что они являются побочными продуктами и что гистидин участвует в образовании промежуточных соединений, быстро образующихся и быстро расп