ли сульфатом аммония. Была получена фракция гидрофобных белков, лишенная фосфолипидов, цитохром--оксидазы и растворимых компонентов, таких, как цитохром с. При добавлении к гидрофобному белковому комплексу соответствующей смелей фосфолипидов (включавшей фосфатидилэтаноламин и фосфатидил-холин) способность к фосфорилированию ADP при окислении NADH коферментом Qi восстанавливалась. Реконструированная система была чувствительна к ингибированию ротеноном (табл. 10-2), разобщающими агентами и олигомицином. На 1 моль окислившегося NADH синтезировалось до 0,5 моль АТР. Имеются также данные об аналогичных успехах в реконструкции участков фосфорилирования 2 и 3 [81].

Попытки расчленить и вновь реконструировать систему окислительного фосфорилирования имеют важнейшее значение в плане постановки будущих экспериментов. Однако при интерпретации результатов возникают значительные трудности. Лишь немногие из компонентов были выделены в совершенно гомогенном состоянии. Необходимо осуществить дальнейшую очистку этих компонентов и исследовать их свойства, и при этом научиться так работать с каждым белком, чтобы не вызывать его денатурации. Вероятно, мы все же можем надеяться, что придет время, когда станет возможным, смешивая многие высоко-очищенные компоненты митохондриальных мембран, реконструировать •функционально активную систему переноса электронов и фосфорилирования. Такого рода эксперименты помогут также ответить на вопрос: обязательно ли для окислительного фосфорилирования нужна мембрана? Хотя, по мнению некоторых исследователей, проведенные эксперименты уже показали, что интактная мембрана при этом может быть и не нужна, никому еще не удавалось осуществить фосфорилирование на «истинно растворимых ферментных препаратах. Синтез АТР наблюдался лишь в тех случаях, когда соответствующие белки были встроены в фосфолипидные «пузырьки».

9. Теории окислительного фосфорилирования и модельные эксперименты

Было предложено множество схем образования высокоэнергетических промежуточных соединений в результате переноса электронов. В этом случае естественна аналогия с субстратным фосфорилировани-•ем, при котором высокоэнергетические промежуточные соединения образуются при переходе электронов от субстрата к субстрату. Как мы уже видели (гл. 8, разд. 3,5), альдегидная группа глицеральдегид-3-фосфата превращается в ацилфосфат, который после переноса фосфат-Ной группы на ADP освобождается в виде карбоксилатной группы. В этом процессе свободная энергия окисления альдегида в карбоксильную группу расходуется на синтез АТР. Реакция отличается от мито-хондриального переноса электронов тем, что продукт 3-фосфоглицери-Новая кислота уже не превращается обратно в глицеральдегид-3-фос-«фат. В то же время переносчики электронов дыхательной цепи должны быть регенерированы в каком-то циклическом процессе. Последнее требование вынуждает искать какие-то иные механизмы окислительного •фосфорилирования.

<г. Теории, основанные на особых химических свойствах электронпереносящего кофермента или щростетической группы

Обзор различных теорий окислительного фосфорилирования [82, ?83] удобно начать, обращаясь снова к уравнению (10-11)1*. Липман [84] предложил общую схему, соответствующую этому уравнению. Последовательность реакций начинается с присоединения группы Y'—ОН [группы Y в уравнении (10-11)] по соответствующей двойной связи между атомами углерода в переносчике ВН2. Хотя реакции изотопного обмена (разд. Д,5) исключают возможность функционирования в качестве Y как ADP, так и Л, все же привлекательно предположение об участии в этом процессе связанного фосфат-иона, принадлежащего, например, фосфолипиду или коферменту. Бедный энергией аддукт Y—ВН2 [уравнение (10-11)] путем окисления превращается в соединение Y~B, близкое по реакционноспособности к ацилфосфату или тиоэфиру.

Важно учитывать, что независимо от природы соединения Y~B фрагмент группы Y остается связанным после переноса Y на X. Таким образом, уравнение (10-11) будет более полным, если Y заменить на Y'OH. В этом случае образующееся соединение имеет форму X^Y', я переносчик остается в форме В—ОН. Для регенерации В необходимо элиминировать гидроксильную группу. При поиске подходящего химического механизма этих стадий окислительного фосфорилирования одна из проблем связана с необходимостью, чтобы такая гидроксиль-ная группа легко элиминировалась.

Хотя в уравнении (10-11) соединение Y присоединяется к восстановленной форме переносчика В с последующим окислением в вькд-* коэнергетическую форму окисленного переносчика, возможно прйССН единение Y и к окисленной форме переносчика В. Затем 'В—Y буД6** восстанавливаться в форму BH2~Y — высокоэнергетическую фор!*^ восстановленного переносчика. После реакции с группой X [как в уравнении (10-П)] останется модифицированный восстановленный переносчик В'Нг, который при последующем элиминировании снова перейдет в форму ВН2, завершив в результате цикл. Таким образом, нам -следует иметь в виду возможность как окисленной, так и восстановленной высок