.]/[восстан.] для цитохрома Ьк. будет равно 1,75. Если теперь варьировать значение RPr то наблюдаемый потенциал переносчика будет меняться в соответствии с уравнением (10-13). Эти изменения наблюдались экспериментально [73]. При десятикратном изменении Rp наблюдаемый потенциал цитохрома Ьк изменится на 0,030 В, как и можно было предсказать для п=2. Наблюдаемый потенциал цитохрома с при каждом десятикратном изменении R р изменяется на 0,059 В, как можно было легко предсказать, учитывая, что л'=2 и что перенос электронов до цитохрома с сопряжен с синтезом двух молекул АТР. Тем самым мы имеем дополнительное экспериментальное подтверждение довольно интересного явления. Даже при функционировании одноэлектронных переносчиков, таких, как Цитохромы, для синтеза одной молекулы АТР требуется прохождение по цепи двух электронов. Кроме того, из подобных экспериментов можно заключить, что участки фосфорилирования расположены примерно так, как показано на рис. 10-11.

Еще один тип экспериментов основан на уравновешивании цепи переноса электронов с внешней окислительно-восстановительной парой, потенциал которой известен, с использованием разобщенных митохондрий. Значение Е0' для данного переносчика можно затем определить по отношению [окисл.]/[восстан.] согласно уравнению (10-12). В то время как изменения в значении уравновешивающего потенциала Е отразятся на отношении [окисл.]/[восстав:.], значение Я07 останется постоянным. Для Fe — S-белков и атомов меди (в белках) в цепи переноса электронов значения можно получить, уравновешивая митохондрии, а затем быстро замораживая их в жидком азоте. Отношения* [окисл.]/[восстан.] далее рассчитываются нз спектров ЭПР, снятых при 77 К. Результаты таких измерений, опубликованные Вильсоном-и Др. [72—75]|, приведены в табл. 10-6.

По значениям Е0* митохондриальные переносчики разбиваются на-четыре изопотеициальиые группы с потенциалами ~—0,30, ~0, ~0,22* и ~0,39 В (табл. 10-6). Когда жестко сопряженные митохондрии переходят в состояние 4 (низкое содержание ADP, высокое содержание АТР, присутствие Ог, но низкая скорость дыхания), наблюдаемые потенциалы изменяются. У самой низкой изопотенцнальной группы, включающей NAD+/NADH, потенциал снижается до —0,38 В, что соответ-ствует состоянию восстановления переносчиков слева от первого участка фосфорилирования на рис. 10-И. Группы 2 и 3 остаются вблизи и» потенциалов средней точки ~—0,05 и +0,26 В. В этих условиях разность потенциалов между последовательными группами переносчиков* составляет ~0,32 В, чего вполне достаточно для образования одной* молекулы АТР на каждую перенесенную пару электронов, при отношении tfp«104 М-1 [уравнение (10-13)].

Два цитохрома ведут себя особым образом и представлены в< табл. 10-6 дважды. Потенциал цитохрома &т в средней точке меняется от —0,030 В в отсутствие АТР до +0,245 В при высоких концентрациях АТР. С другой стороны, значение Е° для цитохрома аз=* =+0,385 В снижается в присутствии АТР до 0,155 В. Этот сдвиг потенциала дает основание думать, что с синтезом АТР сопряжено окисление высокоэнергетической восстановленной формы цитохрома а&! В присутствии высоких концентраций АТР образование этого проме-* жуточного соединения путем восстановления оказывается более труд-' ным (разд. Д, 9,а). Противоположное по направлению изменение для цитохрома Ьт свидетельствует о том, что высокоэнергетической В* этом случае является окисленная форма [уравнение (10-11)]. Правомерность таких выводов зависит от точности и достоверности, с какой* спектроскопические методы позволяют измерять отношение* [окнсл.]!/[восстан.]. На основании этих результатов делали даже вывод о том, что цнтохромы Ьт и аз непосредственно участвуют в процессе окислительного фосфорилирования [72—75]. Однако с этим далеко не все согласны [77].

8. Реконструкция фосфорилирующих частиц

Предпринималось много попыток расчленить и вновь реконструировать субмитохондриальные фосфорнлирующие частицы. Первым из достижений было удаление нескольких «факторов сопряжения», из которых наиболее известен фактор сопряжения Fi (разд. Д,1). Удаление-фактора Fi из субмитохондриальных частиц всегда ведет к потере им» способности синтезировать АТР, но перенос электронов остается незатронутым. Фосфорилирующую способность можно снова восстановить,, добавляя Fi к мембранным препаратам. Следовательно, Fi теснейшим* образом связан с синтезом АТР. Этот важный белок был выделен из митохондрий и из хлоропластов в виде гомогенных частиц с мол. весом '•-'285000. В его состав входят, по-видимому, полипептидные цепи пяти различных типов с молекулярными весами ^60 000, 56 000, 36000, 17000 и 13 000 [78, 79]'.

Солюбилизацию внутренней митохондриальной мембраны можно осуществлять с помощью детергентов. Так, Рэган и Рэкер [80] гомогенизировали митохондрии в растворе сахарозы и добавляли стероидный детергент холат натрия (рис. 12-16), а также другие реагенты. После осторожного перемешивания смеси и центрифугирования надоса-дочную жидкость фракционирова