ому, на то, что в нормальном холоферменте белок может удерживать адениновую группу 5'-дезоксиаденозина при помощи водородной связи с аминогруппой. Поскольку ОН-группа инозина таутомеризуется в С = 0, инозин не может удерживаться столь же прочно.

Доводом в пользу того, что механизм действия этаноламин—амми-ак-лиазы аналогичен приведенному в уравнении (8-77), является перенос 3Н от 5'-3Н-дезоксиаденозилкобаламина как на субстрат L-2-ами-нопропанол, так и на продукт реакции с кинетически уловимыми скоростями [172, 173]. Факт переноса 2Н из положения 1 дейтерированного 2-аминопропанола на метальную группу 5,5-ди-2Н-аденозилкобаламина с образованием 5'-дезоксиаденозина, содержащего группу С2Н3, служит еще одним доводом в пользу этого механизма [173а].

Несмотря на существующие доказательства, предположение о том, что 5'-дезоксиаденозин является промежуточным соединением в витамин В12-зависимых реакциях изомеризации, воспринимается с некоторым недоверием. Трудно поверить, чтобы метильная группа могла так быстро обменивать свои атомы водорода. Протонирование кислорода рибозного кольца, согласно уравнению (8-75), могло бы облегчить диссоциацию атома водорода. Однако при замене кольцевого кислорода группой СНг в синтетическом аналоге коферментная активность не исчезает [163]. Другая возможность заключается в том, что метильная группа приобретает необычную реакционную способность при восстановлении кобальта до Со(П) (см. следующий раздел).

4. Рибонуклеотидредуктаза

Рибонуклеотиды восстанавливаются до дезоксирибонуклеотидов, необходимых для синтеза ДНК, особыми ферментами, действующими на ди- и трифосфаты пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов (гл. 14, разд. Л,1,а). У некоторых организмов для восстановления необходим витамин Bi2. Так, например, у Lactobacillus leichmanii трифосфаты восстанавливаются путем переноса водорода на дитиолы, например на дигидролипоевую кислоту или на дитиоловый белок, тиоредоксин (табл. 8-6). Протоны воды обратимо включаются в 2'-положение восстановленного нуклеотида с сохранением конфигурации. Эти данные указывают на то, что С-2'-атом водорода может переноситься через 5'-дезокси-кобаламин в —SH-группу тиоредоксина, обменивающуюся со средой [174, 175].

Реакция редуктазы с дигидролипоевой кислотой в присутствии dGTP (который, по-видимому, выступает в роли аллостерического активатора) приводит к быстрому (на протяжении нескольких миллисекунд) образованию радикала с характерным ЭПР-спектром, который можно изучить, если реакционную смесь быстро охладить до 130 К. Если вместо dGTP использовать GTP (истинный субстрат), то сигнал радикала достигает максимального значения примерно через 20 мс, а затем уменьшается.

Из всех состояний окисления кобальта (3-f-, 2-f- и l-f) только состояние 2-f- витамина Bi2r является парамагнитным и имеет ЭПР-сиг-нал. Изменения электронного спектра поглощения кофермента рибонуклеотидредуктазы также подтверждают образование Bi2r. Таким образом, возможно гомолитическое расщепление Bi2r со стабилизацией 5'-дезоксиаденозильного радикала [175а]:

сн,к

Со

CH2R (5''-ЬезоксиаЬенозильный радикал)

(8-78)

Б'-дезоксиадено-зилкобаламин

ЭПР-сигнал 5'-дезоксиаденозильного радикала не регистрируется. Поэтому не ясно, акцептируется ли атом водорода дигидролипоевой кислоты или нет. Также не ясно, каков механизм последующего стереоспеци-фического замещения З'-ОН-группы рибонуклеотидного субстрата атомом водорода.

Вслед за рибонуклеотидредуктазой сходные сигналы ЭПР наблюдали и для других ферментов [176—178]. Таким образом, возможно, что во всех случаях начальной стадией является реакция (8-78). Если для реакций перегруппировки выполняется механизм (8-77), то стадию а следовало бы рассматривать как атаку субстрата со стороны либо восстановленного кобальта, либо 5'-дезоксиаденозильного радикала в уравнении (8-78).

5. Изомеризация субстратов

Каким образом изомеризуется субстрат на стадии б уравнения (8-77)? Возможны любые промежуточные соединения: радикал [164], карбоний-ион и карбанион [164а]. Для диолдегидратазы возможно

ксид, способный реагировать далее с В[25 [стадия б в уравнении (8-79)], завершая изомеризацию. С другой стороны, элиминирование ОН" может приводить к равновесной смеси связанного с кобальтом карбкатиона и я-комплекса кобальт—олефин [178а].

В случае метилмалонилмутазы Ингрэм допускает расщепление связи Со—С с образованием карбаниона, причем субстрат-кобаламиновое соединение выступает в роли «биологического реактива Гриньяра». Карбанион может быть стабилизирован карбонильной группой тиоэфи-ра с образованием «гомоенолят-аниона» [уравнение (8-80)]:

о=С / ЕН

S—СОА S—СОА \С\ 5—СОА

Н>~С-СООН Н2С^—С^СООН Н2С^С-СООН (8_80)

?^7 /GMR7

Гомоенолят-аниои

Последний мог бы распадаться по одному из двух путей, приводящих к образованию исходной связи Со—С и к изомеризации субстрата [179, 180].

В случае рибонуклеотидредуктазы интересно выяснить, реагирует ли промежуточное соединение Со(II) с З'-атомом рибонуклеотидного субстрата, ин