тации данных, получаемых в лабораторных условиях, необходимо соблюдать известную осторожность. В настоящее время разработаны методы анализа кинетических данных для случая, когда концентрация фермента превышает /См [28]; использование же обычных уравнений приводит к недопустимо большим ошибкам.

11. Кинетика быстрых реакций

Обычные методы исследования стационарной кинетики не позволяют наблюдать за самыми быстрыми стадиями ферментативного процесса — они применимы только в том случае, когда время полупревращения для реакции превышает 10 с. Поэтому для измерения скоростей реакций со временами полупревращения от Ю-13 до 1 с был разработан целый ряд новых методов [10, 28—30] !>.

а. Струевые методы

Один из первых методов изучения кинетики быстрых реакций основывается на быстром смешивании реагентов, осуществляемом слиянием-потоков двух растворов в специальном смесителе. Далее смесь пропускают через прямую трубку со скоростью несколько метров в секунду. Если скорость составляет 10 м*с-1, то струя проходит 1 см за Ю-3 с. Наблюдать за смесью можно на подходящем расстоянии от места смешивания (например, на расстоянии 1 см) и при различных скоростях струи. Для регистрации образования продукта или расходования субстрата используют спектрофотометрические или другие методы. Достоинством метода является то обстоятельство, что он не требует быст1-рой регистрации, однако его использование сопряжено с расходом больших количеств дефицитных реагентов и прежде всего очищенных ферментов.

Широко применяемый метод остановленной струи основан на быстром смешивании двух растворов за интервал времени, составляющий? всего 1—2 мс (или даже меньше). Струю создают и останавливают посредством плунжера, который приводит в движение два медицинских шприца. Оба раствора поступают в смеситель и далее в кювету, где после остановки струи измеряются поглощение света, э. д. с, электропроводность и т. д. Метод требует быстрой регистрации. Если, например, измеряется поглощение света, то используют фотоумножитель,, подсоединенный к осциллографу. Изменения поглощения, происходящие за доли секунды, регистрируют на экране осциллографа и получен» ный «след» кривой фотографируют. Таким путем можно измерить времена релаксации до нескольких миллисекунд.

б. Релаксационные методы

Кинетические измерения в интервалах времени, составляющих десяти ки микросекунд и менее, проводят с помощью кратковременного возмущения системы, приводящего к небольшому смещению положения, равновесия реакции (или серии реакций), и дальнейшего наблюдения за скоростью достижения нового равновесия (т. е. за процессом релаксации). Наиболее широко применяется метод температурного скачка,, предложенный Эйгеном (Eigen) и его сотрудниками. Между электродами, помещенными в исследуемый раствор, за ^10-6 с создают разность-потенциалов —100 кВ. Быстрый электрический разряд от группы конденсаторов, проходя через раствор (и не приводя при этом к образованию искр), повышает его температуру на 2—10°. Равновесие всех химических реакций, для которых АНФ0, смещается. Измеряя какой-либо параметр системы (например, оптическую плотность при определенной длине волны или электропроводность раствора), можно регистрировать» очень малые времена релаксации.

Хотя это и не очевидно, но, когда смещение положения равновесия мало, установление нового равновесного состояния всегда можно представить как процесс первого порядка [см., например, уравнение (6-13)].

" Можно рекомендовать также сборник Molecular biology, biochemistry and biophysics, v. 24, Chemical relaxation in molecular biology, I. Pecht and R. Rigler (Eds.),. Springer-Verlag, Berlin, 1977, и вышедшую не так давно кингу «Методы исследования' быстрых реакций», Г. Хеммис (ред.) —М.: Мнр, 1977. — Прим. перев.

Если в процессе восстановления равновесия участвует более чем одна химическая реакция, каждой из них соответствует свое характерное ©ремя релаксации. Когда эти времена примерно одинаковы, определить их по отдельности довольно трудно, однако, как правило, времена релаксации разных химических реакций различаются на порядок и даже •более. Таким образом, для исследуемой системы часто удается измерить два и больше времен релаксации. В отдельных случаях эти времена можно прямо связать с константами скорости отдельных стадий. Например, Эйген наблюдал за скоростью взаимодействия Н+ с ОН-, регистрируя изменение электропроводности воды вслед за температурным скачком [10]. При 23 °С величина т составляла 37*10-6 с. Константа скорости процесса

Н++ОН" *Н20 (6.41)

«была рассчитана при помощи следующего соотношения:

^аон-/^]^1-3-'"'-0"1- (6-42)

Скачки давления или напряженности электрического поля могут использоваться в режиме, приводящем к периодическому изменению некоторого параметра системы. Например, поглощение ультразвука .вызывает периодическое изменение давления в системе.

в. Импульсный фотолиз (флеш-фотолиз)

Еще один широко используемый метод — это импульсный фотолиз. Световой импульс, возникающий при разрядке конденсатора импул