полученных при изучении структуры комплексов фермента с различными ингибиторами, например аддукта дегид-рогеназы с NAD+ и пируватом [реакция (8-47) [73]. Таким путем была

Arg-101

РИС. 8-12. Схематическая диаграмма связывания NAD и L-лактата в активном центре лактатдегидрогеназы. Согласно Адамсу и др. [73, 74].

установлена структура активного центра лактатдегидрогеназы (рис. 8-12), На этом рисунке L-лактат изображен в ориентации, благоприятной для переноса гидрид-иона со стороны А никотинамидного кольца. Ионизированная карбоксильная группа лактата удерживается и нейтрализуется гуанидиниевой группой остатка Arg-171, а положение His-195 обеспечивает выполнение им функции общего основного катализатора, отнимающего протон от гидроксильной группы субстрата.

По-видимому, происходит ряд любопытных взаимодействий с боковыми цепями белка. Так, например, отрицательно заряженная боковая цепь глутамата-140 нейтрализует положительный заряд NAD+. На основании исследования модельной реакции предполагается, что это взаимодействие важно для функционирования фермента. Восстановление N-метилакридиний-иона производным дигидроникотинамида следующего строения:

Коферменты — природные специализированные реа1енты л-ы

в растворе акрилонитрила протекает значительно быстрее, чем восстановление аналогичным соединением, не содержащим карбоксилат-иона [74].

Даже до того, как стала известна структура кристаллической лактатдегидрогеназы, отсутствие рН-зависимости связывания кофермента в интервале рН от 5 до 10 наряду с наблюдавшейся инактивацией фермента бутандионом позволило предположить, что пирофосфатная группа NAD+ связывается с гуанидиниевой группой бокового радикала аргинина [75]. Рентгеноструктурные исследования показывают, что эту функцию осуществляет Arg-101 (рис. 8-12). Несколько неожиданным оказалось то, что аминогруппа аденина не образует водородной связи с белком. Аденин скорее всего заключен в гидрофобной щели, а его аминогруппа контактирует с растворителем.

К числу дегидрогеназ, структура которых в настоящее время уже установлена, относятся малатдегидрогеназа [76], неспецифическая ал-когольдегидрогеназа печени [77] и глицеральдегид-3-фосфат—дегидро-геназа (разд. 3,5). Следует отметить, что во всех этих трех дегидроге-назах и в лактатдегидрогеназе имеется примерно одинаковый структурный фрагмент, состоящий из шести плотно упакованных параллельных (3-цепей и нескольких а-спиральных участков [77, 78, 78а] (рис. 2-1 OA). Эта структура, связывающая кофермент, возможно, специально приспособлена к взаимодействию с NAD; в несколько измененной форме она представлена в ряде других ферментов [78а]. Алко-гольдегидрогеназа печени [77] и некоторые другие дегидрогеназы содержат существенный атом Zn2+, способный, вероятно, координационно связывать гидроксильную группу спиртового субстрата или карбонильную группу альдегидного субстрата [786].

3. Конформационные изменения, сопровождающие каталитическое действие дегидрогеназ

В кристаллическом состоянии малатдегидрогеназа сердца свиньи связывает лишь одну молекулу NAD+ на каждый димер, связывание второй молекулы NAD+ происходит значительно труднее [79]. Аналогичная антикооперативность обнаружена в случае глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназы и щелочной фосфатазы (гл. 7, разд. Д,1). Однако единого мнения по поводу таких экспериментальных наблюдений нет [80, 88а] и читателю следует относиться к ним с большой осторожностью. Заманчива мысль, что антикооперативность связывания кофермента отражает кооперативное взаимодействие между субъединицами в ходе катализа. Предположим, что только одна конформация (А) связывает восстановленный субстрат и NAD+, в то время как Другая конформация (В) связывает NADH и окисленный субстрат. Если восстановленный субстрат и NAD+ присутствуют в избытке и окисленный субстрат эффективно удаляется из системы в результате дальнейшего окисления, то в гибридном димере АВ могут происходить следующие явления. Субъединица с конформацией А может связать субстраты, прореагировать и приобрести конформацию В. В то же время вследствие сильного А—В-взаимодействия субъединица, первоначально имевшая конформацию В, может вновь превратиться в А и стать таким образом готовой к тому, чтобы начать новый каталитический цикл. Поскольку конформация А имеет низкое средство к NADH, подобные конформационные изменения в молекуле фермента облегчали бы отщепление восстановленного кофермента [81]. (Известно, что отщепление NADH часто является медленной стадией реакций, катализируемых дегидрогеназами.) Впервые предположение о таком цикле

чередований, или «флип-флоп»-мехаиизме (механизме «качелей»), высказали Харада и Вольф [81а]. Эта идея привлекательна тем, что она делает понятной целесообразность существования в димерной форме многих ферментов, которые не проявляют явных аллостерических свойств. Лаздунский [82] высказал предположение, что флип-флоп-ме-хаиизмы широко распространены у димерных ферментов11, однако еще не ясно, существуют ли они в действительности.

4. Глутаматдег