аже если они располагаются близко друг к другу.

Почему существуют два пиридиновых нуклеотида NAD+ и NADP+, отличающихся только наличием или отсутствием дополнительного-фосфата в нуклеотидной «ручке»? Ответ состоит, по-видимому, в том, что они участвуют в двух, различных окислительно-восстановительных системах, хотя основанных на Никотинамиде, но действующих независимо друг от друга. Экспериментально определяемые отношения [NAD+]/[NADH+] и [NADP+]/[NADPH] заметно различаются. Таким образом, оказывается, что Две системы действуют при различных: окислительно-восстановительных потенциалах в одном и том же участ

ке клетки. Что касается функции этих двух коферментов, то NAD+ чаще всего выступает в роли окислительного агента при отщеплении •атома водорода от субстратов, в то время как NADP+ чаще восстанавливается до NADPH и играет роль восстановителя в биосинтетических процессах.

3. Пиридиннуклеотидные коферменты и дегидрогеназы

В 1904 г. Гарден и Ионг показали, что бесклеточный «сок»1' дрожжей теряет после диализа способность сбраживать глюкозу в спирт и двуокись углерода. По-видимому, процесс сбраживания зависел от наличия какого-то низкомолекулярного вещества, способного проходить через поры мембраны для диализа. Брожение могло быть востановле-но добавлением концентрированного диализата дрожжевого сока или прокипяченного сока дрожжей (в котором ферментные белки были разрушены). В конце концов было установлено, что термостабильный материал, который Гарден и Яиг назвали козимазой, является смесью неорганического фосфата, тиаминдифосфата и NAD. Однако NAD не •был охарактеризован вплоть до 1935 г.

,} Сок получали растиранием дрожжей с песком и фильтрованием. Установление Бухнером (1899 г.) факта, что такой сок дрожжей сбраживает сахар, явилось одной из отправных точек в развитии современной биохимии.

Чистый NAD выделили в 1934 г. из эритроцитов Варбург и Кристиан, которые изучали окисление в этих клетках глюкозо-6-фосфата 167]. Эти исследователи показали, что для брожения требуется какой-то диализуемый кофактор, который был ими охарактеризован и назван трифосфопиридиниуклеотидом (TPN), ныне официально именуемом NADP+ (рис. 8-10). Интересно, что никотинамид еще до признания за ним роли витамина, необходимого в питании человека, был идентифицирован в качестве составной части NAD.

Варбург и Кристиан пришли к заключению о близости NADP к NAD и предположили, что оба эти соединения функционируют в качестве переносчиков водорода путем чередующихся актов восстановления и окисления пиридинового кольца. Они показали, что эти коферВолновое числе, cM~i х Ю-1

L_ _] 1_ I [ [_

500 400 350 300 250 220

Длина волны. ЯЛРИС. 8-11. Спектры поглощения NAD+ и NADH. Спектры NADP+ и NADPH выглядят примерно также. Различие в поглощении окисленной и восстановленной форм при 340 нм является основой, по-видимому, наиболее часто используемого в биохимии спектрального метода. Множество методов определения активности ферментов основано на измерении восстановления NAD+ или NADP+ или окисления NADH или NADPH. Если пиридиннуклеотид не является субстратом изучаемого фермента, то часто можно использовать «методы сопряжения». Например, скорость ферментативного синтеза АТР можно определить, добавляя к реакционной смеси глюкозу+гексокиназу-f-+глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу+NADP+. По мере синтеза АТР фосфорилирует глюкозу (при участии гексокиназы). Затем NADP+ окисляет образующийся глюкозо-6-фосфат с образованием NADPH, скорость синтеза которого регистрируется при 340 им.

менты могут быть восстановлены как ферментативным, так и неферментативным путем при помощи дитионита натрия Na2S204:

SaO|- + NAD+ + Н+ >- NADH + 2S02. (8-39)

Для восстановленных коферментов NADH и NADPH характерна новая спектральная полоса поглощения при 340 нм, отсутствующая у окисленных форм; у последних максимум поглощения лежит при 260 нм (рис. 8-11). Восстановленные формы устойчивы на воздухе, однако установлено, что они могут вновь окисляться под действием определенных «желтых ферментов».

Дополнение 8-3

Никотиновая кислота и никотинамид

Никотиновая кислота была получена в 1867 г. окислением никотина. Она была выделена Функом и независимо от него Судзуки (1911 — 1912гг.) из дрожжей и рисовых отрубей, однако тогда не подозревали, что она является витамином. Биологическое значение никотиновой кислоты установлено впервые в 1935 г., когда было обнаружено, что в со16—189G

242 iлава о

Никотиновая Нихотинамид

кислота

ставЫАБ+ (Эйлер и сотрудники) и NADP+ (Варбург и Кристиан) входит никотинамид.

В 1937 г. Эльвигьем и сотрудники описали лечение болезни «черного языка» у собак с помощью никотиновой кислоты, а затем в том же году несколько групп исследователей сообщили о возможности лечения его пеллагры у человека. В то время пеллагра была очень распространенным заболеванием в США, особенно на Юге. По оценке Национальной службы здоровья США в 1912—1916 гг. насчитывалось ежегодно 100 000 жертв этой болезни, причем 10 000 человек из них