а других

" Однако сдвнг полосы поглощения на 5 нм по сравнению с полосой поглощения свободного РМР, указывает, по-внднмому, на отчетливые изменения в окружении хромофора.

н

I

РИС. 8-9. Спектры поглощения различных форм аспартатамииотрансферазы и свобод-иого пиридоксальфосфата. Поглощение [см. уравнение (13-5)] представлено в виде зависимости от энергии квантов света в единицах волновых чисел. Дана также более широко распространенная шкала длин волн. Чаще в приводимых спектрах длина волны возрастает слева направо. Однако форма, которой мы здесь придерживаемся, в настоящее время становится все более распространенной. Переход фермента из формы, наблюдаемой при низких значениях рН (рН<5), в форму, существующую при высоких значениях рН, контролируется группой с р^Са«6,3. Добавление эритро-В-оксиаспартата приводит к хииоидной форме, спектр которой представлен здесь в одну треть от истинной величины. Спектр свободного PLP получен при рН 8,3. Спектр апофермеита (штриховая линия) характеризуется небольшим остаточным поглощением в области 300—400 нм, причина которого ие выяснена. /— (+)s/7«r/7o-p-OH-Asp. 500 им; II — 430 нм, при низком значении рН; /// — 390 нм, свободный PLP, при рН 8,3; IV — 363 нм, при высоком значении рН; У —330 им, PLP.

было показано, что (как и можно было бы ожидать для шиффова основания) восстановление боргидридом натрия приводит к переходу спектра поглощения в спектр, сходный с таковым РМР, и прочно присоединяет кофермент к белку. После полного гидролиза соляной кислотой таких восстановленных боргидридом белков была получена флуоресцирующая аминокислота, содержащая восстановленный пиридок-сильный остаток; она во всех случаях была идентифицирована как 8-пиридоксиллизин:

сн.он

H+N^^>-H2C

н3с оЕ-ПириЬаксиллизин

Таким образом, PLP-содержащие ферменты в отсутствие субстратов содержат кофермент в форме шиффова основания с е-аминогруппой

лизинового остатка белков1). Возможно, что исключением является 6-аминолевулинат-синтетаза [уравнение (8-20)], в которой предполагается существование аддукта между PLP и —SH-группой активного центра [51].

б. Трансальдиминирование

Образе .ание шиффова основания PLP с субстратом, по-видимому, происхо/ii.r путем присоединения аминогруппы не к С = 0-группе, а к С—N-группе. За присоединением следует элиминирование, но не группы —ОН, а е-гШ2-группы [уравнение (8-28)]:

НзС

Боковая цепь остатка лизина

„Внутреннее" шиффово основание фермента с кофе+рментО/И

(8-28)

Восстановление гликогеифосфорилазы боргидридом натрия приводит к прикреп. лениф PLP к боковой цепи лизииа, ио фермент при этом остается удивительно ак«

Этот механизм, возможно, используется ферментом, потому что присоединение к —HC=NH+ происходит быстрее [52], чем присоединение к —НС=0. Трансальдиминирование подтверждается временным исчезновением положительного кругового дихроизма (КД) (гл. 13, разд. Б,5) в полосе поглощения кофермента при добавлении субстрата. После превращения субстрата круговой дихроизм появляется вновь1'.

е. Полосы поглощения при 500 нм

Наиболее поразительны спектры поглощения, полученные в особых условиях для многих PLP-ферментов они содержат интенсивные и необычно узкие полосы в области 500 нм (20«103 см~!). Такая полоса наблюдается у аспартатаминотрансферазы при ее действии на эритро-^-оксиаспартат (рис. 8-9). Этот псевдосубстрат очень медленно претерпевает переаминирование, и накапливающаяся форма, которая поглощает при 500 нм, возможно, возникает как промежуточная структура и в нормальном каталитическом цикле. Аналогичный спектр поглощения обнаруживается при взаимодействии триптофаназы с конкурентным ингибитором L-аланином. В тех же условиях фермент катализирует быстрый обмен а-водорода аланина с 2Н из 2Н20. Сериноксиме-тилаза дает полосу при 495—500 нм как с D-аланином, так и с нормальным продуктом реакции — глицином [53]. Принято считать, что эти полосы обусловлены предполагаемыми хиноидными промежуточными структурами.

7. Построение детальной картины действия PLP-зависимого фермента

Рассмотрим ряд различных стадий, через которые должен пройти за ~10~3 с каталитический цикл аминотрансферазы. Во-первых, субстрат связывается ферментом с образованием «комплекса Михаэлиса». Затем в две стадии происходит трансальдиминирование [уравнение (8-28)]. за которым следует отделение а-водорода с образованием хи-ноидной формы субстрат-РЬР-имина. Далее требуются еще четыре стадии для образования кетимина, его гидролиза и освобождения кето-•кислотного продукта с образованием РМР-формы фермента. Последовательности стадий для некоторых других фосфопиридоксалевых ферментов еще более сложны.

В случае аспартатаминотрансферазы логично предположить, что положительный заряд аминогруппы субстрата способствует достижению должной ориентации молекулы субстрата благодаря притяжению отрицательным зарядом —0~ в положении 3 кофермента [уравнение (8-28)]. Аналогичным образом некая положительно заряженная группа белка может притягивать а-СОО_-группу субстрата и в ES-к