род располагается позади плоскости листа бумаги. Данатан избрал для исследования пиридоксамин : пируват — аминотрансферазу, фермент родственный PLP-зависимым аминотрансферазам, но для которого субстратами являются пиридоксамин и пиридоксаль0:

Пиридоксамин + Пируват <; > Пиридоксаль -f- L-алаиии. (8-26)

Используя в качестве субстратов пиридоксаль и L-аланин, содержащий дейтерий (^Н) в а-положеиии, он доказал наличие прямого переноса а-водорода аминокислоты в ^-положение образующегося пири-доксамина (на рис. 8-8 отмечено звездочками). Далее было показано» что 2Н включался избирательно в npo-S-положение 4'-углерода пири-доксамина. Эти результаты позволяют предположить, что какая-то группа белка отрывает протон из| а-положения аминокислоты и переносит его по той же поверхности я-еистемы (сип-перенос), присоединяя его к si-стороне С = ЭД-группы. Данатан сделал вывод, что ориентация аминокислотного субстрата совпадает с изображенной на рис. 8-8.

Согласно другим экспериментам, восстановление натрийбортрити-дом (NaB3H4) как альдимина, так и кетимина, образованных субстратами этого фермента, также происходит с si-стороны, свидетельствуя, по-видимому, о том, что данная сторона обращена к доступной взаимодействиям поверхности.

Декарбоксилирование аминокислот в 2Н20 приводит к включению 2Н в про-R-положение — положение, первоначально занимаемое кар-1 боксильной группой (рис. 8-8). Расщепление серина " сериноксиме-тилазой в воде, содержащей 3Н, приводит к включению 3Н в npo-S-положение. Отмечено также стереоспецифическое введение 2Н или 3Н в (3-положение а-кетобутирата, получаемого в реакциях fj- или у-элй-минирования. Превращение серина в триптофан, катализируемое трип-тофансинтетазой, происходит без инверсии при С-3 [49].

6. Наблюдаемые изменения оптических свойств кофермента

Примечательно, что многие коферменты обладают способностью к поглощению света (см. гл. 13). Это свойство проявляется в виде спектра поглощения и может также сопровождаться круговым дихроизмом и флуоресценцией. Оптические свойства коферментных форм витамина В6 особенно чувствительны к изменениям окружающей среды и состояния ионизации различных групп в молекуле. Так, например, РМР в нейтральной биполярной ионной форме, которая преобладает при рН 7, имеет три полосы сильного поглощения света, центры которых находятся при 327, 253 и 217 нм [50].

Большинство различных ионных форм производных витамина В& имеет три полосы поглощения, расположенные примерно в одних и тех же областях, однако положение и интенсивность полос для отдельных форм различны. Например, минорный таутомер РМР, содержащий незаряженное кольцо, имеет низкоэнергетическую (длинноволновую) полосу при 283 нм [уравнение (8-27)]:

?> Реакция (8-26) каталязируется также апофермеитом аспартатаминотраисферазьц причем наблюдается такой же прямой стереоспецифическнй перенос протона, кйк и в случае пиридоксамишпнруват аминотрансферазы [47]. Предполагается, что те же результаты могли бы быть получены и с пиридоксальфосфатом.

IS*

NH

+

сн, О оН3С N'

Н+

Биполярная ионная форма

327нм (30,6 х \&см 253 нм (39,6 х 103 см -») 217 //Af (46,2 X 103 ел* -1)

(8-27)

сн2 О оо

Н—О^ ^СН2 рх

V чон

283 *м (35,3 х 103 см -1)

* Положения полос поглощения даны и в нанометрах н в волновых числах. Волновое число Jy) в см-1 равно 107, деленному иа длину волны в нанометрах (см. гл. 13).

Когда протежированы и азот кольца, и фенольный кислород, полоса поглощения смещается к 294 нм (34,0-103 см-1), а если обе группы депротонированы, то образующийся анион поглощает при 312 нм (21,ЫО3 см-1). Таким образом, изучение спектра поглощения кофер-мента, связанного в комплексе с ферментом, может дать ответ на вопрос о том, протонированы или депротонированы те или иные группы. Например, пик связанного РМР при 330 нм в аспартатаминотрансфе-разе (рис. 8-9) указывает на присутствие биполярной ионной формы [уравнение (8-27) ]•>.

Пиридоксальфосфат представлен равновесной смесью альдегидной и гидратированной альдегидной форм [как в уравнении (7-35)]. Альдегид имеет желтую окраску и поглощает при 390 нм (25,6-103 см-1, рис. 8-9), тогда как гидрат альдегида поглощает примерно в той же области, что и РМР. Полосы поглощения шиффовых оснований PLP еще больше сдвинуты в длинноволновую область, причем N-протони-рованные формы поглощают при 415—430 нм [(23—24) • 103 см-1], тогда как формы с депротонированной C=N-rpynnoft поглощают при более коротких волнах.

а. Иминные группы в свободных ферментах

Исследуя впервые высокоочищенный препарат аспартатамино-трансферазы (в 1957 г.), Дженкинс отметил удивительный факт: связанный кофермент (при рН~5) поглощал не при 390 нм, как PLP, а при 430 нм, подобно шиффову основанию (рис. 8-9). Кроме того, при повышении рН полоса поглощения сдвигалась к 363 нм. Этот результат указывает, по-видимому, на диссоциацию протона (ср/Са~6,3) с разрывом водородной связи в шиффовом основании того же типа, что и на рис. 8-5. Вскоре для этого фермента и для ряд