химический каталог




Катализ в химии и энзимологии

Автор В.Дженкс

присутствии гидроксиламина (даже в том случае, когда в присутствии 1,6 М гидроксиламина половину продукта составляет гидроксамовая кислота), действительно согласуется с представлением, что реакция протекает через общий промежуточный продукт—ацилфермент. К сожалению, в этих опытах не были пороэнь определены константы Михаэлиса и максимальные скорости реакции. В связи с этим очень вероятно, что высокая концентрация гидроксиламина, необходимая для образования заметных количеств гидроксамовой кислоты, неспецифически изменяет один или оба эти кинетических параметра и тем самым мешает обнаружить увеличение суммарной скорости реакции. Интерпретация результатов осложнена также тем, что фермент катализирует гидролиз образующейся гидроксамовой кислоты N-ацетилтирозина.

Частный случай рассматриваемой кинетической схемы — это реакция, где одним из акцепторов является сама уходящая группа А (точнее говоря, продукт, образующийся из нее). Реакция с этим акцептором приводит к образованию исходного субстрата и тем самым ингибирует образование продукта В —X [схема (9)].

х хБ - х + Е А —В + Е —>• В —Е '

4*

52

ГЛАВА 2

При попытке применить этот кинетический метод к исследованию гидролиза под действием химотрипсина гидроксамовой кислоты N-ацетилтирозина сравнивали степень ингибирования этой реакции, наблюдаемую в присутствии гидроксиламина, со степенью ингибирования, предсказанной на основании распределения предполагаемого промежуточного ацилфермента между реакциями гидролиза и гидроксиламинолиза [12]. Для того чтобы определить долю каждой из этих реакций, измеряли в независимом эксперименте количества гидроксамовой и свободной кислот, образующихся под действием химотрипсина из этилового эфира ацетилтирозина в присутствии различных концентраций гидроксиламина [схема (10)].

Ацетилтирозин — О С aHs

1 (10) Ацетилтирозин —Е s '

±nhzoh IJ '%^±Н20

А нет и/гтирозин—И НОН Ацет илт ирозин—ОН

Результаты этих опытов не вполне согласуются с ацилферментным механизмом, однако затруднения в трактовке, возникающие вследствие зависимости отношения скоростей обеих реакций от концентрации фермента, не позволяют строго интерпретировать полученные данные. Более удивительным является тот факт, что скорость реакции синтеза гидроксамовой кислоты N-ацетилтирозина из свободной кислоты [см. нижнюю часть схемы (10)] не обнаруживает той зависимости от концентрации гидроксиламина, которую следовало бы ожидать, если исходить из относительных скоростей гидролиза и гидроксиламинолиза предполагаемого промежуточного ацилфермента. При высоких концентрациях гидроксиламина, когда промежуточный продукт распадается главным образом с образованием гидроксамовой кислоты, эффективная константа скорости этой стадии должна быть более высокой, чем в случае реакции присоединения (или отщепления) воды. Следовательно, синтез гидроксамовой кислоты из свободной кислоты должен лимитироваться скоростью образования ацилфермента, и поэтому скорость синтеза почти не должна зависеть от концентрации гидроксиламина. Однако на опыте это не так. Для объяснения результатов следует предположить влияние некоторого неконтролируемого фактора (например, эффекта растворителя), который искажает скорость реакции так, что с увеличением "концентрации гидроксиламина она перестает стремиться к пределу, или допустить, что реакция не протекает по обычному механизму с участием ацилфермента.

Данную ситуацию можно исследовать полнее, если использовать меченый ингибитор А. При этом можно непосредственно определять скорость обратной реакции продукта А с промежуточным соединением и ее можно сравнить со степенью ингибирования реакции образования продукта В — X. Примеры этого типа будут рассмотрены ниже в разделе, посвященном реакциям обмена.

4. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ПРОМЕЖУТОЧНОГО СОЕДИНЕНИЯ МЕЖДУ ДВУМЯ РЕАКЦИЯМИ РАСПАДА С ПОСТОЯННЫМ ОТНОШЕНИЕМ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОБОИХ ПРОДУКТОВ

Независимо от того, которая из стадий лимитирует скорость реакции, распад общего промежуточного соединения, образующегося из нескольких разных доноров, должен характеризоваться постоянным отношением концентраций продуктов при данных концентрациях акцепторов X и Y [урав-

КОВАЛЕНТНЫЙ КАТАЛИЗ

53

нение (11)]

х .в-Х + Е.

Е-в.

Y В —Y + Е

(И)

Этот критерий, позволяющий судить об образовании промежуточного продукта, исходит из предположения, что фермент не может катализировать реакцию прямого переноса некоторой группы В из молекул разных доноров к акцепторам X и Y при отношении скоростей, одинаковом для всех донорных молекул. Поэтому данный критерий является менее строгим, чем два предыдущих, сущность которых сводится к тому, что при наличии общего промежуточного продукта молекулы с самой различной реакционной способностью превращаются либо с одинаковыми скоростями, либо при постоянной сумме двух скоростей. Иными словами, случайное совпадение величин отношения скоростей является более вероятным, чем случайное совпадение абсолютных скоростей реакций для разных реагентов.

Этот критерий был использован для изучения катализируемых химотрипсином реакций сложных эфиров гиппуровой кислоты с гидроксилами-ном и водой [13]. При постоянной концентрации гидроксиламина различные сложные эфиры, которые существенно различаются по скоростям реакций, реагируют с ферментом с постоянным отношением концентраций продуктов гидроксиламинолиза и гидролиза, т. е. с постоянным отношением концентраций гидроксамовой кислоты и свободной кислоты (табл. 3). Наблюдаемое

Таблица 3

Отношение скоростей гидролиза и гидроксиламинолиза различных эфиров гиппуровой кислоты, катализируемых а-химотрипсином в присутствии 0,1 М гидроксиламина [13]

Эфир гиппуровой кислоты Отношение скоростей гидроксиламинолиза и гидролиза ферментативная реакция рН 6,7 неферментативная реакция рН 12

Метиловый 0,37 0,99

Изопропиловый 0,38 0,29

Гомохолиновый 0,37 1,73

4-Пиридинилметиловый 0,37 3,03

постоянное отношение скоростей обеих реакций указывает, по-видимому, на то, что гидроксиламин и вода реагируют с общим промежуточным продуктом гиппурилферментом. Этот вывод подтверждается тем фактом, что отношение скоростей гидролиза и гидроксиламинолиза в неферментативной реакции при рН 12 различается для разных сложных эфиров (табл. 3). Тем не менее трудно исключить однозначно возможность того, что фермент может катализировать прямую атаку гидроксиламином и водой различных эфиров с одинаковыми относительными скоростями.

Б. КИНЕТИКА

Несмотря на многочисленные теоретические и экспериментальные работы, исследование стационарной кинетики редко оказывало решающее влияние на объяснение механизма ферментативного действия *. Единствен-

* Автор, несомненно, выражает свою личную точку зрения, с которой, как можно думать, согласятся далеко не все энзимологи.— Прим. ред.

54

ГЛАВА 2

ный пример кинетического поведения субстрата в стационарных условиях, которое можно непосредственно интерпретировать в рамках определенного механизма, это кинетические закономерности, выражаемые в виде параллельных прямых в координатной системе обратных величин скорости реакции и концентрации субстрата (l/v — 1/[S]0). Закономерности этого типа позволяют предположить, что суммарная реакция включает две стадии с образованием какого-либо промежуточного комплекса или соединения фермента с субстратной группой, участвующей в реакции переноса [«пинг-понг»-механизм, схема (12)] [14].

А—В + Е ^ А—В-Е ^ В— Е + А

В —Е + Х ^ Х-В-Е ^ X—В + Е (12)

т-тЕгИаг+^+О (13)

Кинетика такой реакции описывается уравнением (13). Это уравнение не содержит члена с произведением концентраций типа ЯУ[АВ][Х], который обычно входит в выражение для скорости реакции при наличии тройного комплекса или в случае других механизмов. Именно этот член и обусловливает пересечение прямых в координатной системе двойных обратных величин. Однако данный механизм кинетически нельзя доказать однозначно, поскольку отдельные кинетические константы реакции, например те, которые входят в член с произведением концентраций, могут быть слишком небольшими, чтобы этот член можно было обнаружить экспериментально. Следовательно, аналогичное кинетическое поведение может имитировать также и механизм с участием тройного комплекса, в котором первая стадия является медленной и по существу необратимой [14, 15]. Тем не менее наблюдение «пинг-понг»-кинетики приносит, по-видимому, наибольшую информацию из всех кинетических результатов, полученных при изучении ферментативных реакций в стационарных условиях. Дело в том, что на основании наблюдаемых кинетических закономерностей можно предположить определенный химический механизм, который затем можно проверить экспериментально.

Наиболее широко известными ферментами, которые действуют по «пинг-понг»-механизму переноса субстратной группы, являются трансаминазы, где промежуточное соединение фермента с группой В содержит амино-группу, которая участвует в реакции переноса в виде связанного пиридоксаминфос-фатного кофермента [16]. Такие же кинетические закономерности характерны для реакций с участием ряда флавиновых ферментов, где водород переносится как часть связанного восстановленного кофермента [17], или реакции с участием нуклеозиддифосфокиназы и фосфоглюкомутазы, которые катализируют перенос фосфатной группы, идущий через промежуточный фосфорил-фермент [18], или также реакции с участием фосфорилазы сахарозы, которая катализирует перенос глюкозы, образуя промежуточный глюкозилфер-мент [19]. В качестве примера на рис. 4 приведены кинетические закономерности в виде параллельных прямых для сукцинил-КоА-ацетоацетил-КоА-трансферазы, которая катализирует перенос КоА от одной ацильной группы к другой через промежуточное образование КоА — фермента согласно механизму (14) [20].

сукцинил-КоА + Е ^ сукцинил-КоА-Е ^ Е — КоА-(-сукцинат

Е — КоА+ацетоацетат ^ ацетоацетил-КоА-Е ^ ацетоацетил-КоА + Е (14)

Интерпретация таких механизмов реакций исходит из представления, что они состоят из двух полуреакций. В данном случае легко понять, хотя бы качественно, почему прямые в координатной системе двойных обратных величин не пересекаются в точке на оси ординат, соответствующей некоторой

КОВАЛЕНТНЫЙ КАТАЛИЗ

55

общей максимальной скорости реакции. Рассмотрим в качестве примера реакцию, которая описывается схемой (14). Если изучать эту реакцию при малой концентрации сукцинил-КоА, то первая полуреакция будет протекать с присущей ей малой скоростью, и, независимо от того, сколько будет добавлено ацетоацетата, истинная максимальная скорость суммарной реакции не будет достигнута из-за ограниченной скорости первой полуреакции. Подобным же образом, если зафиксировать концентрацию ацетоацетата, невозможно достигнуть истинной максимальной скорости реакции увеличением концентрации одного сукцинил-КоА, поскольку в этом случае общая скорость будет лимитироваться малой скоростью второй полуреакции.

_I_I_I_I_' I_

О 1,0 2,0 3,0

1/[Сукцинил-Ш] ¦ Ю3

Рис. 4. «Пинг-понт»-кинетика в реакции ацетоацетата с сукцинил-КоА, катализируемой КоА-трансферазой [20].

Механизмы (12) и (14) являются, несомненно, упрощенными для реакций подобного рода, поскольку они не учитывают возможного связывания ферментом уходящей молекулы А и акцептора X; тот факт, что фермент обнаруживает некоторую специфичность по отношению к этим молекулам, указывает, что такие центры связывания должны, безусловно, существовать. Уточненный механизм, включающий взаимодействие с центрами связывания, представлен в виде схемы (15).

А—В + Е ^ А-В-Е ^ В-Е-А ^ В—Е + А (15)

В—Е+Х ^ В-Е-Х ^ Х-В-Е ^ Х-В+Е

Кинетические закономерности, которые следуют из уравнения (15), являются такими же, как и в случае более простых урванений (12) и (14), хотя детальная интерпретация кажущихся кинетических констант является несколько другой. Однако существование центров связывания приводит к тому, что молекула акцептора X может связываться свободным ферментом и влиять таким образом на связывание им молекулы А — В, что приводит к своеобразному ингибированию субстратом. Для данного класса реакций такое поведение является обычным и приводит к отклонениям от параллельности прямых в координатах обратных величин при высоких концентрациях субстрата.

В отсутствие осложняющих факторов ингибирование молекулой донора А является конкурентным по отношению к молекуле акцептора X и неконкурентным по отношению к исходному субстрату А — В. Такую картину наблюдали, например, при ингибировании КоА-трансферазы сукцинатом, конкурентным по отношению к ацетоацетату и неконкурентным по отношению к сукцинил-КоА (рис. 5). В простейшем случае ингибирование можно рассматривать как проявление обратимости первой полуреакции. В при-

56

ГЛАВА 2

сутствии сукцината промежуточный КоА — фермент, который образовался из сукцинил-КоА, будет частично реагировать с сукцинатом, регенерируя исходный субстрат. Эта обратная реакция конкурирует с реакцией, в которой под действием ацетоацетата образуется продукт. Фактически ацетоацетат и сукцинат конкурируют между собой за реакцию с промежуточным продуктом ферментативного процесса. Ингибирование можно частично предотвратить добавлением большего количества сукцинил-КоА для увеличения скорости первой полуреакции, однако некоторая доля промежуточного соединения всегда будет реагировать с сукцинатом, образуя исходный субстрат вместо продуктов. При наличии заметного связывания молекул А или X ферментом механизм реакции следует интерпретировать несколько иначе (кинетические закономерности такого осложняющего влияния были рассмотрены выше для реакции в отсутствие ингибитора).

Детальное рассмотрение «пинг-понг»-механизма приводит ко всем четырем известным соотношениям Холдена, которые иллюстрируют связь между

Сукцинил - КоЛ+ацетоацетат—» ацетоацетил- КоА+

о 0.5 1.0 О 1,0 2,0 3,0

Ацетоацетат] • 10s \Сцкцинил-КоЯ[ -103

Рис. 5. Ингибирование сукцинатом реакции, катализируемой КоА-трансферазой, конкурентное по отношению к ацетоацетату и неконкурентное по отношению к сукци-

нил-КоА [20].

суммарными константами равновесия ферментативной реакции и наблюдаемыми кинетическими константами [21]. Соответствие кинетических констант этим четырем соотношениям может служить дополнительным подтверждением справедливости данного механизма.

6. РЕАКЦИИ ОБМЕНА И ПЕРЕНОСА

Часто полагают, что наличие изотопного обмена, катализируемого ферментом, или протекание реакций переноса химических групп может само по себе служить доказательством существования ковалентного фермент-субстратного промежуточного соединения. Однако в отсутствие дополнительной информации такой вывод неправомочен. Нет никаких оснований считать, что перенос группы В из А — В к X, катализируемый ферментом и протекающий через промежуточное соединение фермент — В [схема (16)1

| А-В | | В | $±± | В-Х [

фермент фермент фермент (Щ

более вероятен, чем прямое замещение А на X [схема (17)]. Подобным же-образом обмен изотопно меченной группы А*, входящей в АВ, также может протекать либо через промежуточное соединение фермент — В [схема (18)]Т

КОВАЛ

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

Скачать книгу "Катализ в химии и энзимологии" (4.04Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить маникюрный набор
москва контактные линзы он-лайн
курсы обучения для женщин маникюрщиц железнодорожный
курсы косметологии на курской

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)