химический каталог




Катализ в химии и энзимологии

Автор В.Дженкс

вления таких изменений, индуцируемых в белковой молекуле химической реакцией, имеет особое значение для фермента, который участвует в превращении химической энергии в механическую в процессе сжатия мускулов.

Начальный выброс га-нитрофенола в реакции химотрипсина с НФА также соответствует 1 молю продукта на каждый моль фермента. В данном случае это стехиометрическое соотношение находит более простое объяснение [4], которое заключается в том, что в реакции химотрипсина с НФА образуется ацилфермент и при этом происходит выделение одного эквивалента га-нитрофенола. Это объяснение согласуется с тем, что ацилфермент можно выделить из разбавленного кислого раствора, где он относительно стабилен. Ацилфермент может реагировать с гидроксиламином и другими акцепторами ацильной группы с образованием 1 моля ацилированного акцептора. Такой промежуточный продукт, как триметилацетилхимотрипсин, был даже выделен в кристаллическом виде [4]. Этот успех приобретает особое значение в связи с тем, что всего несколько лет назад обсуждалось, существуют ли вообще фермент-субстратные промежуточные соединения.

Несмотря на то что НФА является химически высокореакционным соединением, это плохой субстрат химотрипсина. Поэтому для изучения его гидролиза необходимо использовать большие концентрации фермента. Именно благодаря этим высоким концентрациям фермента, а также тому, что превращение НФА под действием фермента является достаточно медленным после достижения стационарного состояния реакции, и удалось обнаружить первоначальный выброс га-нитрофенола. Позднее выброс продукта

КОВАЛЕНТНЫЙ КАТАЛИЗ

47

в начальный момент был показан также для реакции химотрипсина со специфическим субстратом, а именно га-нитрофениловым эфиром N-ацетил-L-триптофана в интервале значений рН 2—4. В этих условиях скорость-гидролиза даже столь специфического субстрата является достаточно медленной, что позволяет использовать высокую концентрацию фермента при достаточно низкой стационарной скорости превращения субстрата [5].

За образованием и распадом фермент-субстратных промежуточных соединений можно непосредственно наблюдать в случае медленно реагирующих субстратов, или в неблагоприятных условиях для протекания реакции,

200 300 WO SOO SOO 700 800 900 Время, с

Рис. 2. Изменение оптической реакции ]М-ацетил-т_гтриптофана

плотности раствора, соответствующее протеканию» (А) и метилового эфира N-ацетил-ь-триптофана (В) с химотрипсином при рН 2,42 [5].

или при наличии специальной аппаратуры для изучения быстрых реакций. Так, при взаимодействии небольших количеств метилового эфира N-ацетил-L-триптофана с химотрипсином при рН 2,42 происходит сначала небольшое уменьшение, а затем увеличение оптической плотности раствора при 311 нм (рис. 2) [5]. Значение константы скорости, характеризующей увеличение поглощения, совпадает с величиной, которая следует из максимальной скорости гидролиза га-нитрофенилового эфира N-ацетил-ь-триптофана в тех же условиях. Последняя величина характеризует скорость деацилирования ацилфермента [схема (3), к3], поскольку стадия ацилирования в случае га-нитрофениловых эфиров протекает значительно быстрее стадии деацилирования. Такое совпадение значений констант скоростей, полученных в двух независимых опытах, позволяет предположить, что правая ветвь кривой Б на рис. 2 отражает деацилирование того же ацилфермента, но образовавшегося в реакции химотрипсина с метиловым эфиром. Кривая А отражает аналогичный эксперимент со свободной кислотой (N-ацетил-ь-триптофан). Наблюдаемое спектральное изменение можно связать с появлением конформационных изменений в ферменте, индуцируемых субстратом, однако более вероятным является другое объяснение: кривая А описывает ацилирование фермента N-ацетил-ь-триптофаном с образованием равновесной смеси свободного и ацилированного фермента. С этим согласуется тот факт, что величина начального выброса продукта при добавлении к ферменту ге-нитро-фенилового эфира N-ацетил-ь-триптофана и, следовательно, количество свободного фермента, который может быть проацилирован, уменьшаются после предварительного инкубирования фермента с данной кислотой. Наблюдая за изменением количества свободного фермента при различных концентрациях кислоты, можно вычислить константу равновесия образования

48

ГЛАВА 2

ацилфермента из свободной кислоты и химотрипсина. Скорость образования ацилфермента из свободной кислоты при более высоких значениях рН можно приблизительно оценить по скорости обмена 180 между водой и N-ацетил-L-триптофаном [уравнение (4), рН 7,9], если принять, что фермент

ацилируется лишь неионизованной формой кислоты. Кроме того, необходимо учесть поправки на зависимость ферментативной активности от значения рН и на количество свободной кислоты, существующей при рН 7,9. Проведенное рассмотрение показывает, что даже такой плохо реагирующий субстрат, каким является карбоксилат-ион, может реагировать с ферментом в виде более реакционной свободной кислоты, образуя ацилфермент. Гораздо большие спектральные изменения при ацилировании и деацилировании обнаруживают менее специфические субстраты типа производных цинна-моила, фуроила или бензоила, которые также реагируют с химотрипсином, образуя ацилфермент. Эти соединения оказались удобными для кинетических исследований стадии ацилирования и деацилирования в условиях, когда обе реакции протекают достаточно медленно, и для их изучения можно использовать обычную спектрофотометрическую аппаратуру [6, 7].

Краситель профлавин связывается с активным центром химотрипсина, при этом спектральные свойства его изменяются. Наблюдаемое смещение спектра можно положить в основу метода измерения констант скоростей и равновесий при образовании и распаде фермент-субстратных промежуточных продуктов, поскольку взаимодействие субстрата с активным центром предотвращает связывание красителя [8].

Основное экспериментальное ограничение всех этих методов заключается в том, что за образованием и распадом промежуточных соединений можно наблюдать непосредственно лишь при наличии значительных количеств чистого фермента. Ниже описаны косвенные методы, которые позволяют использовать для этой же цели каталитические количества фермента, л нет необходимости даже применять чистый фермент, если только примеси не влияют на его активность.

2. РАСПАД С ОДИНАКОВОЙ СКОРОСТЬЮ ОБЩЕГО ПРОМЕЖУТОЧНОГО СОЕДИНЕНИЯ, ОБРАЗОВАВШЕГОСЯ ИЗ РАЗНЫХ СУБСТРАТОВ

Если имеется ряд сложных эфиров с одинаковой ацильной группой, по с разными уходящими группами и эти эфиры быстро реагируют с ферментом, образуя промежуточный ацилфермент, который затем медленно гидролизуется, то максимальная скорость ферментативного гидролиза всех этих сложных эфиров должна быть одинаковой, поскольку скорость определяющей стадией будет гидролиз общего для всех случаев ацилфермента [уравнение (5), к3]. В табл. 2 приведены в качестве примера данные по гидролизу папаином ряда сложных эфиров карбобензоксиглицина. Близкие

RCOO-+H20* ^ RCOO*-4-H20

(4)

Ацил— Xrf + Е

Ацил

Xd-E

(5)

КОВАЛЕНТНЫЙ КАТАЛИЗ

49

Таблица 2

Скорости реакций сложных эфиров карбобензоксиглицина при 25° [9]

Реакция, катализируемая папаином (рН 6,8) Неферментативный гидролиз *оН-> л • моль-1-с-1

Сложный эфир Кд/, моль/л-10-5 V С-1 умакс u п-Нитрофениловый ж-Нитрофениловый о-Нитрофениловый Фениловый Этиловый 0,93 1,89 15,2 10,7 514 2,73 2,18 2,14 2,45 1,90 115 67,5 61,5 12,1 0,676

значения максимальных скоростей гидролиза различных сложных эфиров позволяют предположить, что во всех реакциях существует общий промежуточный ацилфермент (карбобен8оксиглицилпапаин), гидролиз которого с константой скорости к3 лимитирует скорость реакции с ферментом всех указанных сложных эфиров [9].

В большинстве экспериментов подобного рода максимальные скорости гидролиза различных сложных эфиров все-таки несколько различаются. Для объяснения этих различий можно указать на следующие причины:

а) Ошибки измерений. Ошибку в измерениях скорости указывают не всегда, однако в тех случаях, когда ошибка приведена, она, как правило, меньше наблюдаемых различий в скорости. Это может свидетельствовать либо о чрезмерной самоуверенности некоторых исследователей, либо о том, что разница в скорости действительно является реальной и требует объяснения.

б) Общее промежуточное соединение отсутствует, но скорости случайно совпадают. Если субстраты химически близки, то не удивительно, что фермент катализирует их гидролиз, протекающий по механизму с прямым участием воды, с близкими, но не совсем идентичными скоростями. Это объяснение маловероятно в случае, где сложные эфиры сильно различаются своей реакционной способностью, как это видно из табл. 2, в которой приведены константы скорости их щелочного гидролиза (&он-)-

в) Скорость определяющей стадией является конформационное изменение фермента. Если для протекания ферментативной реакции необходимо конформационное изменение фермента, индуцируемое субстратом-, то маловероятно, чтобы эта стадия в случае различных субстратов протекала с одинаковой скоростью, тем не менее скорости могут быть близкими (гл. 5, разд. Д.).

г) Различия в эффективности ингибирования продуктом для различных реакций. Этого осложнения можно избежать, измеряя истинные начальные скорости. Кроме того, это объяснение можно проверить непосредственно путем добавления продукта.

д) Ингибирование субстратом. Несмотря на то что ингибирование субстратом при связывании его с ацилферментом легко наблюдать кинетически, при малых глубинах ингибирования данный механизм можно и не обнаружить. Последнее может привести к различиям в кажущейся константе скорости реакции для разных субстратов.

е) Скорость реакции определяет стадия, контролируемая диффузией. Столкновение реагентов с компонентами растворителя или перемещение группы фермента в каталитически активное положение может протекать с исключительно большими скоростями. Однако если этим процессам предшествует хотя бы одна или несколько неблагоприятных равновесных стадий, то они могут лимитировать скорость протекания даже относительно медленной реакции. В этом случае при наличии общей для разных субстратов ско-

4-0500

50

ГЛАВА 2

рость определяющей стадии такого типа будет наблюдаться одинаковая скорость реакции.

ж) Распад ковалентного фермент-субстратного промежуточного соединения не полностью определяет скорость реакции. Скорость ацилирования в ряду доноров, где свойства уходящей группы постепенно ухудшаются, должна соответственно замедляться. Когда скорость ацилирования станет равной скорости стадии деацилирования, то наблюдаемая максимальная скорость реакции уменьшится, поскольку ацилирование частично начнет лимитировать общую скорость процесса. При наличии очень «плохой» уходящей группы в молекуле ацилирующего агента стадия ацилирования может полностью определять скорость реакции. Именно так стоит вопрос при гидролизе химотрипсином амидных субстратов. Амиды под действием химотрипсина гидролизуются на несколько порядков медленнее сложных эфиров, содержащих ту же ацильную группу. Более медленная реакция этилового эфира (табл. 2) может означать, что при гидролизе этого субстрата папаином ацилирование частично лимитирует скорость процесса.

Хорошо известно, что константа диссоциации первоначального фермент-субстратного комплекса Ks не обязательно совпадает с константой Михаэлиса Км. В ряде случаев это обусловлено образованием фермент-субстратного

промежуточного соединения [см., например, уравнение (3) или (5)]. Для реакции, в которой начальная стадия связывания быстрая, соотношение между этими константами дается уравнением (6) [10]. В том случае, когда скорость реакции лимитируется ацилированием и деацилирование идет быстро, т. е. к3 ^> к2, уравнение-(6) можно упростить:

Км —К*

(6>

Рис. 3. Зависимость величины i/KM в реакции, катализируемой папаином, от константы скорости щелочного гидролиза ряда сложных эфиров карбобензоксиглицина при 25 °С [9].

и наблюдаемая на опыте константа Михаэлиса оказывается действительно равной константе-диссоциации фермент-субстратного комплекса,. т. е. KM=KS. В противном случае, когда скорость реакции лимитируется деацилированием, т. е. к3 <^ к2, выражение для константы Михаэлиса можно привести к виду Км = Ksk3/k2 и,, как видно, оно включает константы скоростей всех стадий процесса. Если значения истинной константы диссоциации Ks для ряда субстратов

постоянна, то переменной величиной в измеряемом значении Км будет лишь константа скорости стадии ацилирования к2. Следовательно, в этом случае изменение-константы Михаэлиса для разных субстратов будет обусловлено лишь изменением одной этой константы скорости. Значения констант Михаэлиса для" катализируемой папаином реакции гидролиза ряда сложных эфиров карбобензоксиглицина уменьшаются в обратной зависимости от скорости неферментативной реакции этих сложных эфиров с ионом гидроксила (табл. 2, рис. 3). Точка, которая на рисунке остается ниже прямой, соответствует пространственно затрудненному о-нитрофениловому эфиру. Таким образом, тот факт, что константа Михаэлиса уменьшается по мере того, как улучшаются свойства уходящей группы, указывает лишь на увеличение реакционной способности субстрата, которое проявляется как в увеличении константы скорости ацилирования (к2), так и константы скорости щелочного, гидролиза (koS-).

КОВАЛЕНТНЫЙ КАТАЛИЗ

51

3. распределение промежуточного продукта между

двумя реакциями распада с постоянной общей скоростью

Рассмотрим реакцию, в которой скорость определяющей стадией является образование промежуточного продукта, реагирующего далее с двумя акцепторами и дающего разные продукты [уравнение (7)]. Если варьировать концентрации акцепторов, то распределение промежуточного продукта между этими реакциями будет меняться, однако сумма скоростей образования обоих продуктов останется неизменной и будет соответствовать скорости образования промежуточного продукта [схема (7)1.

х В-Х + Е

К3 _ медленно^ ,

А-В + Б А-В • Е -» В-Е (7)

— А \ 4 '

* B-Y + Е

Не так давно был поставлен вопрос, протекает ли катализируемый химотрипсином гидролиз амидов через промежуточный ацилфермент или же молекула амида, сорбированная на активном центре фермента, подвергается прямой атаке водой или другим акцептором. При попытке решить данный вопрос с использованием рассмотренного кинетического метода были изучены ферментативные реакции гидролиза и гидроксиламинолиза ге-нитроанилида N-ацетилтирозина при различных концентрациях гидроксиламина [схема (8)1 111].

-NH2CeH4N02

ацетилтирозил—NHC6H4N03-T-Enz--*¦

У ацетилтирозил — ОН —+¦ ацетилтирозил—Enz ^ ^

^ ацетилтирозил—NHOH

Если полагать, что катализируемый химотрипсином гидролиэ амидов и анилидов протекает через промежуточный ацилфермент, то образование промежуточного продукта, несомненно, лимитирует скорость реакции, поскольку ферментативный гидролиз сложных эфиров с той же ацильной группой идет значительно быстрее. Тот факт, что суммарная скорость реакции, измеряемая по выделению га-нитроанилина, почти не меняется в

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

Скачать книгу "Катализ в химии и энзимологии" (4.04Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кресло 9970
Фирма Ренессанс лестница из металла - продажа, доставка, монтаж.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(30.04.2017)