соответственно:

ег

AvK= 2,mDERkT ' (4)

р 2,mDER4T ' W

В уравнении (5) — дипольный момент, ? — угол между осью диполя и линией, соединяющей его с зарядом. Тенфорд отметил, что эта модель очень чувствительна к глубинам погружения заряда и диполя в полости,

17—0500

258

ГЛАВА 6

и нашел, что вычисления электростатических взаимодействии для ряда ионизирующихся групп приводят к удовлетворительным результатам в предположении, что заряды находятся на глубине 1 А, а диполи — на глубине 1,5 А под поверхностью полости [13].

Эти модели, очевидно, не вполне соответствуют реальной картине, создающейся в такой сложной ситуации. Использование «эффективной диэлектрической проницаемости» и представления о «глубине погружения в полость» дают лишь полуэмпирические пути решения проблемы определения микроскопической диэлектрической проницаемости, диэлектрического насыщения, максимального приближения молекул растворителя и других величин. Тем не менее эти пути логически непротиворечивы и позволяют оценить влияние электростатических сил на константы диссоциации ряда ионизирующихся групп, не образующих водородных связей. В случае дикарбоновых кислот, способных к образованию водородной связи, они должны давать по крайней мере грубую оценку вклада электростатических сил в наблюдаемый сдвиг трК. Подобные оценки указывают на то, что электростатические эффекты могут объяснить в основном все отклонения в константах диссоциации как малеиновой кислоты по сравнению с фумаровой, так и ряда других дикарбоновых кислот [14, 15]. Приближенность вычислений не позволяет сделать однозначный вывод о том, что образование водородной связи в рассмотренных случаях несущественно, однако становится очевидной необходимость ряда независимых доказательств при установлении наличия водородной связи в этих соединениях.

Гораздо большие значения АрК наблюдаются у карбоновых кислот с объемистыми заместителями, которые заставляют карбоксильные группы максимально сближаться между собой: значения рК рацемической 2,3-ди-?пре?п-бутилянтарной кислоты равны 2,2 и 10,25, что приводит к очень большой величине АрК = 8 [16]. Большие значения АрК для этих кислот можно объяснить как образованием сильной водородной связи в моноанионе (чему благоприятствуют большие заместители), так и сильным электростатическим отталкиванием двух связанных отрицательных зарядов в дианионе, которое, возможно, усилено десольватирующим действием заместителей.

Более простой эмпирический подход заключается в сравнении значений рК дикарбоновой кислоты, в которой ожидается образование внутримолекулярной водородной связи, и соответствующего моноэфира {схема (6)} [17].

О

II

^-COR

0 ( и=атал, Н

Н ^СОО"

С ||

^-СООН u

с

С-0

с-6'

II

о

ч

Н R = Н

Полярные эффекты атома водорода в дикарбоновой кислоте и алкильной группы в моноэфире отличаются незначительно, так что стабилизация моноаниона, вызываемая образованием водородной связи, должна проявляться в понижении рКг дикарбоновой кислоты по сравнению с моноэфиром. При этом необходимо вносить статистическую поправку в константу диссоциации дикарбоновой кислоты на множитель, равный 2, так как в кислоте ионизируются две эквивалентные группы, а в эфире — только одна. Разница

ВОДОРОДНАЯ СВЯЗЬ

259

в величинах рК малеиновой кислоты (рК = 1,91) и ее моноэфира (рК = 3,08) соответствует примерно 14-кратной разнице в константах диссоциации. Отсюда следует, что стабилизация моноаниона водородной связью приводит к 7-кратной разнице в константах. Это небольшой, но, по-видимому, вполне реальный эффект.

Другое подтверждение существования циклической водородной связи в моноанионах дикарбоновых кислот подходящей структуры, таких, как малеат, следует из наблюдений сдвигов в спектрах ЯМР протонов углеводородного остова этих кислот. Положение сигнала в спектре ЯМР смещается в сторону слабого поля при ионизации кислоты до моноиона, тогда, как обычно, ионизация карбоновых кислот, которые не могут образовывать внутримолекулярных водородных связей, таких, как фумаровая кислота, сопровождается смещением сигналов протонов при а- и р-углеродных атомах в сторону сильного поля [18]. К сожалению, теоретическая интерпретация этих смещений еще не вполне определенна.

Образование водородной связи между двумя карбоксильными группами, одна из которых находится в ионизированном состоянии, должно приводить к укорочению связи в карбонильной группе аниона, который становится похожим на недиссоциированную карбоксильную группу, и к удлинению связи в карбонильной группе кислоты, которая приближается к ионизированному состоянию [уравнение (7)]

О _ О О t-0

I: II i: <-) :l п\

RC-0 + Н —О — CR RC—О-Н-О —CR V '

Такие изменения должны проявляться в валентных частотах этих групп в инфракрасной области. Инфракрасные спектры растворенных в окиси дейтерия кислот, в которых может существовать внутримолекулярная водородная связь, подтверждают, хотя и не вполне согласованно, это предположение [15, 19, 20]. Карбоксильная группа моноаниона ди-и-пропилма-лоновой кислоты дает ожидаемый сдвиг в область низких частот по сравнению с моноанионом малоновой кислоты, что указывает на присутствие внутримолекулярной водородной связи в первом соединении. Однако моноанион малеиновой кислоты обнаруживает небольшой сдвиг в противоположном направлении по сравнению с фумаратом (табл. 2). В салицилате по срав-

Таблица 2

Валентные частоты карбонильной группы в инфракрасных спектрах моноанионов карбоновых кислот в окиси дейтерия [20]

Моноанион V -СООН, см-1 гасимм -соо-, см-1

Малеат 1698 1570

Фумарат 1690 1577

Малонат 1698 1588

Ди-к-пропилмалонат 1677 1586

Салицилат — 1621

Бензоат — 1553

нению с бензоатом наблюдается значительный сдвиг частоты в том направлении, которое ожидается в случае образования водородной связи в первом анионе, однако отсутствует возрастание в частоте ионизированной карбоксильной группы ди-и-пропилмалоната по сравнению с малонатом. Наблюдаются большие различия в сдвиге частоты карбонильной группы, который возникает при ионизации соседней карбоксильной группы [20]. Следует,

17*

260

ГЛАВА 6

однако, быть осторожным при интерпретации этих изменений как доказательства образования водородной связи, так как сдвиг частоты карбоксильной группы может до некоторой степени отражать отклонение частоты в моно-анионе по сравнению с дианионом, вызываемое электростатическим взаимодействием.

Самое убедительное доказательство существования внутримолекулярной водородной связи следует из измерений скоростей удаления протона гид-роксильным ионом из карбоновой кислоты, содержащей водородную связь [21, 22]. Константы скорости удаления протона из бензойной и уксусной кислот, составляющие 3,5-Ю10 и .4,5-Ю10 л/моль-с соответственно, не зависят от силы кислоты и находятся в пределах констант скоростей процессов, лимитируемых диффузией. В противоположность этому константы скорости удаления протона из моноанионов ди-и-пропилмалоновой и малоновой кислот, а также из салицилатной группы молекулы красителя составляют 5,3-107, 7,4-108 и1,4-107 л/моль-с соответственно [21]. В ряду моноанионов константы скорости изменяются обратно пропорционально отношению констант диссоциации K\IKZ [22]. Уменьшение этих скоростей на несколько порядков по сравнению со скоростями диффузионно контролируемых процессов, наблюдаемыми для других кислот, указывают на тормозящую роль каких-то факторов в этих реакциях. Наиболее вероятным объяснением является предположение об образовании внутримолекулярной водородной связи, в результате чего понижается способность протона к реакции с ионом гидроксила.

Способность гидроксилсодержащих растворителей разрывать водородную связь, даже в случае особо благоприятной обстановки для ее образования, видна на примере салицилальдегида и о-оксибензофенонов [23]. Бензальдегиды и бензофеноны обычно обладают фосфоресценцией, связанной с дезактивацией триплетного состояния. В неполярных растворителях присутствие в ортгао-положении гидроксильной группы приводит к исчезновению фосфоресценции вследствие быстрого тушения возбужденного триплетного состояния протоном образовавшейся внутримолекулярной водородной связи. Добавление гидроксилсодержащего растворителя, например этанола, приводит к возобновлению нормальной фосфоресценции, вероятно, потому, что образование межмолекулярной водородной связи с таким растворителем приводит к разрыву внутримолекулярной водородной связи с карбонильной группой [схема (8)]

4. БЕЛКИ, ПЕПТИДЫ И МОЧЕВИНА

Водородная связь между амидными группами в а-спирали и других регулярных структурах, встречающихся в белках (III), представляет наибольший интерес, так как участвует в поддержании белковой структуры. Поэтому важно установить, обладает ли такая водородная связь в воде достаточной устойчивостью, чтобы служить движущей силой образования таких структур.

R

,с = 0 •¦• н —n

н-n/ |

[ R R'

III

ВОДОРОДНАЯ СВЯЗЬ

261

СС14

V

Во второй части данного раздела было отмечено, что, за исключением особых случаев, таких, как ион бифторида, монофункциональные водородные связи между небольшими молекулами в водном растворе чрезвычайно неустойчивы. Этот вывод распространяется также и на водородные связи между амидами. Возникновение межмолекулярной водородной связи между молекулами N-метилацет-амида в четыреххлористом углероде было подтверждено обнаружением сдвига обертона валентной частоты связи N — Н-амида из высокочастотной области (где поглощает мономер) в низкочастотную область, где находится широкая полоса поглощения димера или полимера, появляющихся при возрастании концентрации амида от 0,01 до" 1,0 моль/л (рис. 1) [24]. В диоксане атомы кислорода молекул растворителя конкурируют с амидными карбонильными группами в качестве акцептора водорода, и в этом растворителе необходимо повысить концентрацию амида до 3 моль/л, чтобы получить полосу поглощения агрегата. В воде, молекулы которой конкурируют как с донором, так и с акцептором водорода, полоса поглощения агрегата не появляется до тех пор, пока присутствует значительное количество воды и частицы, связанные межмолекулярной водородной связью, появляются только в почти чистом N-метилацетамиде, когда его концентрация превышает концентрацию воды (рис. 1). Из этих результатов следует, что водородные связи между отдельными молекулами амида не обладают заметной устойчивостью в водном растворе. Изменение коэффициента активности мочевины в концентрированном растворе можно объяснить образованием димеров мочевины при помощи водородной связи [25]. Однако спектральные исследования в ближней инфракрасной области, проведенные для растворов мочевины и 6-валеролактама [соединений, в принципе способных образовывать циклические димеры (IV)], не подтверждают образования этими соединениями в воде устойчивой водородной связи [24, 26].

1.S 1.В 1,7 Длина волны, мк

Рис. 1. Спектры мономера и связанного водородной связью димера или агрегата N-метилацетами-да в ближней инфракрасной области в растворах в четыреххлористом углероде, диоксане и воде.

Концентрации растворенного вещества: в ССЦ - 0,01 мопь/п, .............

1 мопь/п; в диоксане-3 моль/л;

в воде

-0,2 мопь/п,

7 мопь/п, ............. 12,5 мопь/п [24].

-N'

С = 0..

н

Н. N-

о=сГ

Ж

Таким образом, отсутствуют надежные доказательства, подтверждающие широко принимавшуюся до сих пор гипотезу о том, что водородные связи между амидными группами обеспечивают энергию стабилизации, необходимую для поддержания нативной структуры белков, и о том, что денатурирующие агенты типа мочевины и гидрохлорида гуанидина вызывают денатурацию, конкурируя с карбонильным кислородом и амидным водородом за образование водородной связи внутри пептидной цепи [27]. После осозна-

262

ГЛАВА 6

ния этого факта всеобщее мнение довольно резко качнулось в сторону той точки зрения, в соответствии с которой образование таких водородных связей не может служить движущей силой поддержания белковой структуры в водном растворе или денатурации белков мочевиной и гуанидином. Это мнение получило дальнейшее подтверждение, когда было обнаружено,

растворимость (т. е. понижают коэффициент активности) неполярных молекул. Следовательно, они должны способствовать денатурации, делая более благоприятным контакт растворителя с гидрофобными боковыми группами аминокислот, которые до денатурации находятся внутри белковой глобулы [28—30].

В настоящее время вновь начинают отходить от общепринятой точки зрения в обратном направлении, но признаков стабилизации пока не наблюдается. Во всяком случае, нет сомнения в том, что водородные связи между амидными группами должны существовать в а-спирали и В-струк-туре внутри белка, даже если они не обеспечивают стабилизацию этих структур. Действительно, при образовании водородных связей достигается самое устойчивое расположение амидных групп в белке при условии, что они не будут обращены к воде. Более того, для взаимодействия денатурирующих агентов с модельными пептидами, аминокислотами и многими (но не всеми) белками необходимо присутствие незамещенного атома водорода на атоме азота денатурирующего агента [31—33]. Мочевина и гидрохлорид гуанидина значительно увеличивают растворимость этилового эфира ацетилтетраглицина (ЭЭАТГ) в воде (рис. 2).

ООООО

II II II II II

С H3CN HCH2CN HCH2GN HGH2CN HGH2GO G2H5

ЭЭАТГ

Это значит, что такие денатурирующие агенты взаимодействуют в растворе с тетрапептидом, моделирующим амидные группы полипептидной цепи, понижая его энергию. Следовательно, можно ожидать, что они будут способствовать денатурации белка, аналогичным образом взаимодействуя с его амидными группами. Этот эффект уменьшается при замещении атомов водорода денатурирующего агента алкильными группами, и тетралкилмочевина и гидрохлорид тетраметилгуанидина вызывают уже уменьшение растворимости ЭЭАТГ. Так как алкилирование приводит к возрастанию солюбили-зирующей способности мочевины и гидрохлорида гуанидина по отношению к неполярным молекулам [33], то их взаимодействие с пептидом не может быть по своей природе гидрофобным. Денатурация бычьего сывороточного альбумина денатурирующими агентами этого типа также требует наличия незамещенных атомов водорода [32]. Проще всего это можно объяснить тем, что денатурирующий агент взаимодействует с пептидными группами с образованием водородных связей.

На основании этих результатов можно предположить, что, хотя монофункциональная водородная связь не обладает значительной устойчивостью в водном растворе, образование полифункциональных водородных связей

что мочевина и гуанидин увеличивают в,0г

МочеВина

2 4 6 8 мопъ/п \Моче8ина\ или \гуанидин- HCl]

Рис. 2. Растворимость этилового эфира ацетилтетраглицина в водных растворах мочевины при 0, 25 и 40 °С и гидрохлорида гуанидина при 25 °С [33].

ВОДОРОДНАЯ связь

263

может давать существенный вклад в движущую силу межмолекулярного взаимодействия в воде. Ниже приведена (V) одна из возможных структур, возникающих при образовании водородной связи между мочевиной или гидрохлоридом г