химический каталог




Катализ в химии и энзимологии

Автор В.Дженкс

вании иона фер-рицианида в качестве акцептора электрона. Замещение дейтерием в положении 4 НАДНг не сказывается на константе Михаэлиса, но уменьшает максимальную скорость реакции в 3,7 раза для НАДН2 и в 10,4 и 8,7 раэа для ацетилпиридинового и пиридинальдегидного аналогов кофермента соответственно, если замещается атом водорода с той стороны кольца, которая примыкает к реакционному центру и участвует в реакции. Замещение другого атома водорода в положении 4 на дейтерий не дает заметного изотопного эффекта. Однако до настоящего времени еще не объяснены два факта, наблюдаемые для этого относительно «нормального» фермента: 1) непонятно различие в изотопных эффектах, которое обнаруживают разные аналоги кофермента; 2) непонятен тот факт, что дейтерий не обменивается с растворителем даже в течение больших периодов времени, хотя можно ожидать что он переносится на атом азота, связанного с ферментом флавина, и должен бы затем быстро обмениваться с растворителем.

Изотопные эффекты в ферментативных реакциях, которые проводят в окиси дейтерия, нельзя интерпретировать строго, хотя из данных достаточно детального исследования можно с различной степенью уверенности сделать определенные выводы. Прежде всего наобходимо определить, насколько наблюдаемый изотопный эффект отражает изменения характеристик* различных ионогенных форм фермента или субстрата при замене воды на окись дейтерия. Кислотность растворов в окиси дейтерия можно определить при помощи обычных стеклянных электродов, если к наблюдаемым показаниям рН-метра, который прокалиброван обычным стандартным буфером в водном растворе, прибавить поправку, равную 0,4 [74]. Желательна проверка этой процедуры непосредственным сравнением показаний рН-метра, полученных •с 0,001М НС1 в воде и с 0,001 М DC1 в окиси дейтерия. Различие в константах ионизации субстрата в воде и в окиси дейтерия можно определить непосредственно; соответствующее различие активных форм фермента можно обнаружить лишь из зависимости ферментативной активности от рН (или pD), либо путем изучения изотопного влияния на кислотность ионогенных групп, о которых известно, что они важны для проявления ферментативной активности. Сопоставление изотопных эффектов ионизации различного типа ионогенных групп было сделано Бантоном и Шайнером [17]. В окиси дейтерия большинство кислот в 3 — 5 раз слабее, чем в воде, что соответствует разнице в значении рК 0,5...0,7 единицы.

На глядным примером зависимости изотопного эффекта от рН (рис. 5) является поведение цитратконденсирующего фермента в воде и окиси

НАДН2+Еп2 Zl Enz — Н -f- НАД+,

Enz —Н + акцепторокисл ^ Enz-f-aKH;enTopBOCcT.

(28) (29)

ИЗОТОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ

219

дейтерия [75]. Различие в зависимости скорости реакции от кислотности в этих двух растворителях ведет в тому, что изотопный эффект меняется от максимального значения 3,5 до обратного изотопного эффекта, наблюдаемого в щелочных растворах. Очевидно, определение скорости при одном значении рН (pD) нельзя интерпретировать сколько-нибудь разумно. Наблюдаемая зависимость скорости реакции от кислотности в этих двух растворителях, по-видимому, отражает как изотопный эффект ионизации активных форм фермента, так и изотопный эффект скорости реакции активных ионогенных частиц фермента. Интересно отметить, что в этой реакции наблюдается большой изотопный эффект в константе Михаэлиса для ацетил-КоА, который с изменением кислотности меняется в пределах 6,3...0,8.

Наиболее серьезная трудность в интерпретации изотопных эффектов ферментативных реакций заключается в том, что при замене воды на окись дейтерия существует определенная вероятность изменения конформации фермента вследствие изменений свойств водородных связей, гидрофобных взаимодействий или других факторов. Сами по себе эти эффекты малы, но они могут быть усилены в ферментативной реакции, в которой существует тонкое равновесие между конформациями различной степени активности. Имеется непосредственное свидетельство того, что такое изменение растворителя может влиять на конформацию фермента: так, «температура плавления» рибонуклеазы в окиси дейтерия на 4 °С выше, чем в воде [76]. Кроме того, методом температурного скачка было показано, что скорость внутримолекулярной изомеризации рибонуклеазы, которая по-видимому, включает перенос протона, в окиси дейтерия в 4 — 6 раз меньше, чем в воде [77]. Двукратное увеличение скорости гидролиза га-нитрофенилпропионата, катализируемого карбоангидразой в окиси дейтерия, по-видимому, можно связать с таким конформационным изменением [78] * .

Некоторые возможные причины влияния изотопного замещения на стабильность различных конформации фермента уже обсуждались; следует добавить, что при дейтериевом замещении существенно изменяются также и длины водородных связей. Так, кристаллографическое исследование дигидрата щавелевой кислоты показало, что при замещении водорода на дейтерий расстояние О — Н — О увеличивается примерно на 0.04А [79]. Если структура субстрата строго соответствует структуре активного центра (расположению боковых цепей аминокислот, составляющих первичную последовательность), то, очевидно, при дейтериевом замещении это соответствие может существенно нарушаться за счет изменения длины нескольких водородных связей.

Необходимо помнить, что большой изотопный эффект трития может привести к сильному торможению переноса атомов трития в опытах по конкурентному введению изотопов, что в свою очередь может служить поводом для неправильных выводов относительно источника данного атома водорода. Если превращение О-фосфо- L-гомосерина в треонин, катализируемое треонин-

* Этот изотопный эффект, который наблюдается в области плато рН-профиля, нельзя связать с большей нуклеофильностью OD- по сравнению с ОН-, поскольку при данном значении рН (pD) концентрация OD- будет в 6,5 раз меньше, чем концентрация OH-([78], табл. 1).

_I_I_1_I_I_1

2 « S в 10 11 14 рН(рШ

Рис. 5. Зависимость от рН и pD максимальной скорости реакции, катализируемой цитратконденсирую-щим ферментом в воде и окиси дейтерия [75].

220

ГЛАВА 4

синтетазой, проводить в 100%-ной окиси дейтерия, то один атом дейтерия включается в ^-положение продукта реакции (другой атом включается в ОС-положение) [схема (30)].

н * н f -

г-03РОСН2СНаССОО- ^ CHg-C-CCOO" (30> NH3+ НО NH3*

Однако если реакцию проводят в воде, содержащей следы трития, то включение трития в ^-положение составляет всего лишь 2% по отношению к количеству, которое следовало бы ожидать при отсутствии изотопного эффект» [80]. Наблюдаемый большой изотопный эффект (около 50) не является необычным для трития. Изотопный эффект трития в экспериментах по включению-изотопов можно уменьшить, если опыты проводить с использованием окиси дейтерия в качестве растворителя, поскольку в этом случае уменьшается различие в массах атомов.

Эта реакция представляет собой один из примеров, в которых важно сделать четкое различие между экспериментами, проводимыми в чистой окиси дейтерия или с субстратом, полностью помеченным дейтерием, и экспериментами, проводимыми со смесями изотопно-меченных реагентов или. растворителей. В первом случае все реакции протекают только с изотопно-меченным соединением и непосредственно из результатов измерений скоростей с мечеными и немечеными субстратами можно сделать определенные выводы. В последнем случае равновесная или стационарная концентрация изотопно меченного промежуточного соединения может меняться сложным образом в зависимости от кинетики реакции и необходим детальный кинетический анализ для правильной интерпретации величины изотопного эффекта. Измерения скоростей и распределения продуктов в ферментативных реакциях, изученных в смесях вода — окись дейтерия, часто приводят к различающимся результатам, по-видимому, вследствие вторичных изотопных эффектов, как было отмечено в разд. Г,5 для неферментативных реакций.

2. ВЛИЯНИЕ ИЗОТОПНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ НА КОНСТАНТУ МИХАЭЛИСА

Если бы константа Михаэлиса была простой константой связывания и если бы изотопные эффекты вызывались полной потерей нулевой энергии валентного колебания в переходном состоянии, можно было бы ожидать, что изотопные эффекты не будут проявляться в константе Михаэлиса ферментативной реакции. Поскольку ни одно из этих предположений не является полностью справедливым, не удивительно, что существование изотопного влияния на константу Михаэлиса является скорее правилом, чем исключением. Интересно отметить, что существует большое и необъясненное различие (до 30%) в адсорбции различных изотопов водорода на активированном угле [81]. Ниже рассмотрены возможные причины изотопных эффектов константы Михаэлиса.

а) Наличие заметного кинетического члена в константе Михаэлиса. Даже для простейшей ферментативной реакции, представленной схемой (31), константа Михаэлиса, помимо константы диссоциации включает также и константу скорости к2; константы Михаэлиса для более сложных механизмов реакции в общем случае будут также содержать кинетические константы:

_ki ft2

E + S t *" ES —*¦ E + продукты, fe-i

(31)

ЛИТЕРАТУРА

221

Если эти кинетические константы достаточно велики и ими нельзя пренебречь в выражении для константы Михаэлиса, то изотопный эффект, например, константы скорости к2 проявится и в константе Михаэлиса. Такие изотопные эффекты в константах Михаэлиса для соединений, меченных дейтерием в положениях, не способных к обмену с растворителем, могут быть полезны для интерпретации химического смысла этих констант.

б) Эксперименты с использованием окиси дейтерия в качестве растворителя. Трудности в интерпретации таких экспериментов обсуждались выше. В частности, влияние окиси дейтерия на рК субстратов или ионогенных форм фермента, принимающих участие в связывании субстрата, так же как влияние окиси дейтерия на конформацию фермента, может приводить к изменениям константы Михаэлиса. Кроме того, «неспецифические» влияния окиси дейтерия как растворителя на коэффициенты активности •субстрата и (или) активного центра фермента (что проявляется, например, •в различных растворимостях субстрата в воде и в окиси дейтерия) могут на 30—40% изменять константу Михаэлиса.

в) Стерические эффекты. Возможно, что небольшое различие в эффективных радиусах водорода и дейтерия может приводить к различиям в связывании за счет чисто стерических эффектов. В настоящее время мало известно о силовых константах и возможной жесткости активных центров ферментов, чтобы с какой-либо определенностью можно было сказать, важен ли этот эффект. Однако тот факт, что стерические изотопные эффекты наблюдаются только в неферментативных реакциях с чрезвычайно строгими стерическими требованиями, и определенная вероятность того, что активные центры ферментов имеют хоть малую степень конформационной подвижности, позволяют заключить, что небольшое стерическое различие между водород- и дейтерийсодержащими молекулами не должно заметно сказываться на константе связывания.

г) Поляризуемость. Несколько большая поляризуемость связей с водородом по сравнению со связями с дейтерием может привести к несколько меньшему связыванию дейтерированных соединений, однако ожидаемые величины этих эффектов должны быть даже меньше, чем величины стерических эффектов, и они лежат, по-видимому, в пределах экспериментальных ошибок большинства определений констант связывания.

е) Напряжение. Если образование фермент-субстратного комплекса включает использование связывающих сил для активации субстрата и принудительного перевода его в положение, приближающееся к переходному состоянию, то конечное изменение частот и нулевых энергий связей с водородом должно приводить к изотопному эффекту константы связывания субстрата. Другими словами, такая реакция, как удаление протона, может уже в некоторой степени протекать в комплексе Михаэлиса (гл. 5). Такой изотопный эффект был бы фактически доказательством существования напряжений в фермент-субстратном комплексе, если можно было быть твердо уверенным, что он не вызывается наличием заметного кинетического члена в константе Михаэлиса или стерическими эффектами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Wiberg К. В., Chem. Rev., 55,713 '1955); Melander L., Isotope Sffects on Reaction Rates, The Ronald Press Company, New York, 1960; Bell R. P., The Proton in Chemistry, chap. XI, Cornell University Oress, Ithaca, N. Y., 1959; Wiberg К. В., Physical Organic Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1964, p. 351 —364.

2. Reitz O., Kopp J., Z. Physik. Chem., 184 A, 429 (1939).

3. Seltzer S., Hamilton G. A., Westheimer F. H., J. Am. Chem. Soc, 81, 4018 (1959).

4. Lewis E S., Funderburk L. H., J. Am. Chem. Soc, 89, 2322 (1967); Lewis E. S., Ro-

binson J. K., ibid., 90, 4337 (1968).

5. Anbar M., Meyerstein D., J. Phys. Chem., 68, 3184 (1964).

222

ЛИТЕРАТУРА

6. CramD. J., Scott D. A., Nielsen W. D., J. Am. Chem. Soc, 83 , 3696 (1961); Ford W. Т., Graham E. W., Cram D. J., ibid., 89, 4661 (1967).

7. Jencks W. P., Carriuolo J. J. Am. Chem. Soc, 82, 675 (1960).

8. Gross Ph., Steiner #., Suess #., Trans. Faraday Soc, 32, 883 (1936).

9. Bigeleisen J., J. Chem. Phys., 17, 675 (1949); Bigeleisen J., Wolfsberg M., Advan. Chem.

Phys., 1, 15 (1958).

10. Westheimer F. H., Chem. Rev., 61, 265 (1961).

11. Melander L., Isotope Effects on Reaction Rates, The Ronald Press Company, New York, 1960.

12. Kreevoy M. M., J. Chem. Ed., 41, 636 (1964).

13. Swain C. G., Stivers E. C, Reuwer J.F., J., SchaadL. J., I. Am. Chem. Soc, 80, 5885 (1958).

14. Bell R. P., The Proton in Chemistry, Cornell University Press, Ithaca, N.Y., p. 183, i 959

15. Rule' С. К., La Мег V. K., J. Am. Chem. Soc, 60, 1974 (1938).

16. Bell R. P., Kuhn А. Т., Trans. Faraday Soc, 59, 1789 (1963).

17. Bunton C. A., Shiner V. J., Jr., J. Am. Chem. Soc, 83, 42 (1961).

18. Lienhard G. E., Jencks W.P., J. Am. Chem. Soc, 88, 3982 (1966).

19. Bunton C. A., Shiner V. J., Jr., J. Am. Chem. Soc, 83, 3207, 3214 (1961).

20. Halevi E. A., Progr. Phys. Org. Chem., 1, 109 (1963).

21. Thornton E. R., Ann. Rev. Phys. Chem., 17, 349 (1966).

22. Streitwieser A., Jr., Jagow R. #., Fahey R. C, Suzuki S., J. Am. Chem. Soc, 80, 2326-

(1958) .

23. Мосек M. M., Stewart R., Can. J. Chem., 41, 1641 (1963).

24. Bell R. P., Miller W. В. Т., Trans. Faraday Soc, 59, 1147 (1963).

25. Bell R. P., Crooks J. E., Trans. Faraday Soc, 58, 1409 (1962).

26. Traficante D. D., Maciel G. E., J. Am. Chem. Soc, 87, 4917 (1965).

27. Jones J. M., Bender M. L., J. Am. Chem. Soc, 82, 6322 (1960).

28. Bender M. L., Feng M. S., J. Am. Chem. Soc, 82, 6318 (1960).

29. Halevi E. A., Margolin Z., Proc. Chem. Soc, 1964, 174.

30. Shiner V. J., Jr., J. Am. Chem. Soc, 82, 2655 (1960).

31. Bartell L. S., Roskos R. R., J. Chem. Phys., 44, 457 (1966).

32. Ingold С. K., Raisin C. G., Wilson C. L., J. Chem. Soc, 1936, 915.

33. Mislow K., Graeve R., Gordon A. J., Wahl G. H., Jr., J. Am. Chem. Soc, 86, 1733 (1964).

34. Swain C. G., Bader R. F. W., Tetrahedron Letters, 10, 182 (1960).

35. Davies D. H., Benson G. C, Can. J. Chem., 43, 3100 (1965).

36. Wu Y-C, Friedman H. L., J. Ph

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

Скачать книгу "Катализ в химии и энзимологии" (4.04Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы компьютерных дизайнеров
Стеллаж СБ-200
посуда konig официальный сайт
садовая мебель купить в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)