химический каталог




Катализ в химии и энзимологии

Автор В.Дженкс

у тот факт, что происходит внутримолекулярный перенос трития, предполагает, что связанный г^ис-аконитат может вращаться без обмена протона с растворителем, оставаясь привязанным к ферменту.

ОБЩИЙ КИСЛОТНО-ОСНОВНОЙ КАТАЛИЗ

177

2. химотрипсин

В ферментативных реакциях, которые включают перенос протона к атомам или от атомов кислорода, азота или серы, точно доказать прохождение общего кислотно-основного катализа еще труднее. В настоящее время самые строгие свидетельства в пользу его существования в ферментативных реакциях имеются для химотрипсина. В гл. 2 было показано, что гидролиз этим ферментом субстратов, которые содержат активированную ацильную группу, протекает в процессе ковалентного катализа с промежуточным образованием ацилсеринового эфира [схема (76)].

О О О

II ±XIL II н2о || RCX +HOCepEnz ~Zl RCOCepEnz-->- RCO~ + HOCepEnz (76)

Однако существуют веские свидетельства в пользу того, что для проявления каталитической активности необходима имидазольная группа остатка гистидина в активном центре фермента. Зависимость от рН максимальных скоростей как стадии ацилирования, так и деацилирования показывает, что активность фермента пропорциональна доле основной формы группы с рК ~ 7, что лежит в области рК, ожидаемой для имидазольной группы. Одно это не может служить строгим доказательством, что имидазольная группа включается в активный центр; это значение рК может отражать: 1) ионизацию некоторой другой ионогенной группы, величина рК которой искажена белком; 2) имидазольную группу, протонизация которой вызывает образование каталитически неактивной конформации фермента; 3) изменение скорость определяющей стадии, а не ионизацию какой-либо группы. Более строгое свидетельство, что имидазольная группа участвует в катализе, следует из факта, что фермент необратимо инактивируется при алкилировании имидазольной группы аналогом субстрата хлоркетоном VIII.

О

<^_СН2СНССН2С1

nh

I

OSO

СН3

VIII

Эта молекула похожа на нормальный субстрат фермента при связывании на активном центре—в течение короткого времени хлоркетон VIII функционирует как конкурентный ингибитор фермента, а другие конкурентные ингибиторы защищают фермент от необратимой инактивации этим соединением,— однако затем происходит медленная, но специфическая реакция с имидазольной группой [79]. Поскольку нет свидетельств, что эта имидазольная группа действует как нуклеофильный катализатор, чаще всего полагают, что она выступает в качестве общеосновного катализатора, облегчая перенос протона. Известно, что имидазол действует таким образом при катализе ферментативного гидролиза эфиров [10, 80, 81]. Существует два рода свидетельств, подтверждающих такую роль имидазола в ферментативных реакциях.

Во-первых, изотопные эффекты дейтерия &Н2о /&г>2ов реакции гидролиза промежуточных ацилферментов, циннамоилхимотрипсина и бензоилхимотри-псина лежат в диапазоне от 2 до'4, что подобно изотопным эффектам, найденным для общеосновного катализа соответствующих неферментативных

12—0500

178

глава 3

реакций [10, 81, 84]. Трудность в интерпретации таких изотопных эффектов заключаются в том, что они могут быть результатом незначительных обратимых конформационных изменений фермента, которые возникают при замене обычной воды как растворителя на окись дейтерия. Хотя удалось показать, что большие или необратимые изменения в конформации белка [84] при такой замене растворителя не происходят, возможность существования небольших или обратимых эффектов означает, что наличие изотопного эффекта дейтерия может служить лишь указанием на возможность, а не доказательством существования общеосновного катализа в ферментативной реакции.

Во-вторых, существование корреляции структура — реакционная способность является свидетельством в пользу механизма общеосновного катализа [85]. В некатализируемой (или катализируемой водой) реакции аминов с эфирами скорость реакции обычно очень чувствительна к основности амина, так что зависимость log к от рК имеет наклон ~0,8. Это справедливо как для третичных аминов, так и для первичных и вторичных и означает, что удаление протона от нуклеофильного реагента в переходном состоянии не имеет существенного значения и что действие электронооттягивающих заместителей проявляется в уменьшении нуклеофильной способности за счет уменьшения электронной плотности на реакционном центре. С другой стороны, реакция спиртов с эфирами при нейтральных значениях рН обнаруживает обратную чувствительность к заместителям, а именно увеличение реакционной способности при повышении кислотности спирта. Последнее является следствием того, что активная частица — это анион спирта, и влияние электронооттягивающего заместителя сводится к увеличению равновесной концентрации аниона [уравнение (77)], что важнее, чем понижение им реакционной способности этого аниона [уравнение (78)]

КА

roh ro-+h+ (77) о о

И Ь Н /тол

rc-4-r'cor"-->- r'cor+r"0- (78)

Таким образом, в реакции, в которой не удаляется протон в переходном состоянии, электронооттягивающие заместители уменьшают реакционную способность, в то время как в реакции с полным удалением протона в переходном состоянии такие заместители повышают реакционную способность. Естественно, что в реакциях с промежуточной степенью переноса протона в переходном состоянии они будут давать промежуточные эффекты. Экспериментально было найдено, что для структурнородственных соединений как аминов, так и спиртов реакции с промежуточным ацилферментом (фуро-илхимотрипсином) имеют слабую, или даже нулевую, чувствительность к основности нуклеофила. Это значит, что в данном случае происходит небольшое изменение заряда на атакующем атоме в переходном состоянии ферментативной реакции, и указывает на то, что в переходном состоянии протон не переносится полностью, как в спиртах, не остается без перемещения, как в аминах, а переносится частично, так что эффекты заместителя на нуклеофильную реакционную способность и на перенос протона взаимно погашаются. Это соответствует общеосновному катализу.

Подобные рассуждения, основанные на анализе корреляций структура — реакционная способность, могут быть использованы для решения такого трудного вопроса, как установление природы химической группы, которая действует в качестве катализатора в ферментативной реакции. По существу проблема сводится к разрешению кинетической двусмысленности двух простейших механизмов, которые согласуются с тем экспериментально наблюдаемым фактом, что скорость реакции пропорциональна доле имидазольных групп в форме свободного основания. Как было показано выше на примере неферментативных реакций, это не значит, что ими-

ОБЩИЙ КИСЛОТНО-ОСНОВНОЙ КАТАЛИЗ

179

дазол действует как основание при катализе реакции в обоих направлениях. Эта точка зрения обсуждалась в деталях как иллюстрация общей важной проблемы, которую только сейчас начинают принимать во внимание при интерпретации механизма ферментативной реакции.

Уравнение скорости реакции ацилхимотрипсинов с водой или некоторым другим акцептором НХ имеет вид

О О

v = MRCO — Сер — Enz — Im][HX] = к ^*тН> [Rfjo - Сер — Enz — ImH+][X-], (79)

¦"-НХ

где ^1шн+ и .Кнх — соответственно константы кислотной диссоциации имидазольной группы в ферменте и в НХ. Уравнение скорости образования ацилфермента из субстрата RCOX имеет вид

О О

y = fc'[HOCep — Enz — Im][RCX] = fc' ^lmH+ [-OCep-Enz —ImH+][RCX], (80)

где ^серон — константа кислотной диссоциации гидроксильной группы серина в активном центре фермента. Будем считать, что правильным является простейший механизм, который включает указанные реагирующие группы. В таком случае реакция деацилирования могла бы иметь место либо по механизму (81), согласно которому имидазол действует как общеосновной катализатор, облегчая удаление протона от атакующего нуклеофила, либо по механизму (82), в соответствии с которым сопряженная кислота имидазола действует на атом кислорода серина как общекислонытй катализатор и атакующим агентом является сопряженное основание нуклеофила X". Эти два механизма соответствуют уравнениям скорости (79) и (80) и кинетически неразличимы

'0

I:

• С;

•х-

r

(+) Н-

1т-

Сер

(81)

II

о)

У r-K-lm-

-о^Т-с-х Сер

_!_

Ml

r О

-1т-

Сер

¦о-dp

(+)

Н -1т-

(82)

X -С. 0-Н«-ЧтЧ I

Сер

12*

180

ГЛАВА 3

Причина, по которой механизм (82) дает ту же зависимость от рН, что и механизм (81), заключается в том, что эффекты уменьшения концентрации катиона имидазолия и увеличения концентрации сопряженного основания нуклеофила с увеличением рН взаимно уравновешиваются при высоких значениях рН, в то время как при низких значениях рН концентрация иона имидазолия постоянна, а концентрация сопряженного основания нуклеофила увеличивается, давая наблюдаемое увеличение скорости с увеличением рН. Заметим, что в обратном направлении механизм (81) включает атаку субстрата алко-ксидным ионом серина, облегчаемую общекислотным катализом катионом имидазолия отделения группы X. В соответствии с принципом микроскопической обратимости таким должен быть по схеме (81) механизм стадии ацилирования. Таким образом, если имидазол действует как катализатор удаления протона в одном направлении реакции, он должен почти во всех случаях действовать как катализатор передачи протона в другом направлении.

Аналогично механизм (82) требует, чтобы в обратном направлении имидазол действовал как общеосновной катализатор удаления протона от гидроксильной группы серина, которая атакует субстрат. И в этом случае существование специфически основного плюс общекислотного катализа в одном направлении требует, чтобы реакция подвергалась в другом направлении общеосновному катализу. Существенное различие между этими двумя механизмами заключается в том, что уравнение (81) включает перенос протона к группе и от группы X при ее отделении или атаке этой группой, в то время как уравнение (82) включает перенос протона к гидроксильной группе серина и от нее в аналогичных процессах.

Принципы, которые важны для интерпретации практически всех механизмов реакций и которые уже обсуждались на примере некоторых неферментативных реакций, заключаются, во-первых, в том, что механизм, который предполагает передачу протона в одном направлении реакции, должен практически во всех случаях включать удаление протона тем же катализатором в обратном направлении реакции, во-вторых, два или более кинетически эквивалентных механизма, которые обычно могут быть записаны для катализа, являются a priori равновероятными. Эти принципы, когда они высказываются, могут казаться очевидными, но чрезвычайно трудно усваиваются и используются на практике, поскольку энзимолог всегда испытывает искушение предпочесть тот механизм реакции, который соответствует непосредственно наличию тех частиц, которые записаны в уравнении скорости (например, имидазол и гидроксильная группа серина, а не ион имидазолия и алкоксидный ион серина).

Экспериментальное наблюдение, что реакционная способность нуклео-фильных агентов при взаимодействии с ацилхимотрипсином почти не зависит от основности нуклеофила, согласуется с механизмом (81), но трудно объясняется механизмом (82). В соответствии с последним реагирующей частицей является сопряженное основание нуклеофила, участвующее в реакции без помощи частичного переноса протона- Такой механизм предполагает ионизацию нуклеофила, предшествующую скорость определяющей стадии, и должен почти определенно включать изменение заряда нуклеофила в переходном состоянии по сравнению с исходным. Механизм, включающий атаку или удаление свободных анионов аминов, маловероятен в любом случае, поскольку эти анионы термодинамически слишком нестабильны, чтобы существовать в качестве промежуточных соединений умеренно быстрых реакций в водном растворе.

Максимальная скорость гидролиза анилидов под действием химотрипсина обычно [86] (но не всегда [87])увеличивается свведением электронодокор-ных заместителей в кольцо анилина (табл. 4). Это свидетельствует о том, что присоединение протона к уходящей группе, которое облегчается введением электронодонорных заместителей, ускоряет протекание реакции в боль-

ОБЩИЙ КИСЛОТНО-ОСНОВНОЙ КАТАЛИЗ

181

Таблица 4

Катализируемый химотрипсином гидролиз замещенных анилидов ацетилтирозина при рН 8,0 [86]

Замещенный анилин hi- 102, с-1 км- ю*, м рК анилина

JW-C1 — 1,1 8,2 3,3

w-Cl — 1,4 6,7 3,8

ж-СН30 — 4,7 60 4,2

гс-СН3 — 8,7 130 5,1

гс-СНзО — 21 120 5,3

шей степени, чем увеличение «покидающей» способности анилина, которое вызывается оттягиванием электронов. Увеличение скорости идет в том же направлении, что и увеличение основности анилинов, но не в той же степени. Это также соответствует механизму (81) [в обратном направлении], согласно которому в переходном состоянии необходима большая степень переноса протона на анилин, но трудно объясняется механизмом (82).

Протонирование уходящей группы имеет также важное значение при неферментативном гидролизе анилидов [88]. Скорость этой реакции почти не зависит от заместителей (р = 0,1), но обмен меченого кислорода между Щ80 и анилидом возрастает с введением в анилин электронооттягивающих заместителей.

О н

•О Н

* НО-

+ RC-NC6H4X R-C-NC6H4X *ОН

НО"

*0 н НО н

II I k. II

+ RC-NC6H4X *=* R-C-NC6H4X

I

!0

"О н

I 1+

R-C-NC6H4X *0 Н

RCOO" + H2NC6H4X

(83)

В соответствии с механизмом (83) это можно рассматривать как облегчение электронооттягивающими заместителями первой стадии реакции, что способствует увеличению скорости обмена 180 и повышению стационарной концентрации тетраэдрического промежуточного продукта присоединения, и как торможение второй стадии вследствие уменьшения электронной плотности на азоте и степени протонирования анилина, которое необходимо для его отщепления. Положительное влияние электронодонорных заместителей, облегчающих протонизацию на заключительной стадии, может уравновесить неблагоприятный эффект тех же заместителей на первой стадии реакции. Это объясняет наблюдаемое отсутствие чувствительности скорости реакции к природе заместителей.

Механизм действия химитрипсина несомненно включает и другие каталитические факторы, помимо тех, которые представлены уравнениями (81) и (82), и единственным оправданием приведенного выше анализа механизма реакции является возможность получения этим путем более простой картины тех движущих сил, которые возникают на стадиях образования и разрушения связей. Ранее предлагали механизмы более сложные, чем пред-

182

ГЛАВА 3

ставленные схемами (81) и (82), согласно которым как удаление, так и присоединение протона на одной стадии в одном направлении реакции катализируются имидазолом; такие механизмы часто включают в качестве промежуточного соединения тетраэдрический продукт присоединения [89, 90]. Экспериментальных свидетельств, вынуждающих вводить такие механизмы, не существует, однако не исключено, что какой-нибудь механизм такого рода имеет место [схема (84)].

R О )

Сер

R-C-X

сер

г

(84)

R—С— X

0*^-Н — 1т-

с

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

Скачать книгу "Катализ в химии и энзимологии" (4.04Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
http://www.kinash.ru/etrade/goods/4290/city/moscow.html
аквапарк судак горки
спектакль суп из канарейки
сковорода для индукционной плиты

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.07.2017)